整合组蛋白和蛋白质组分析揭示细交链孢菌酮酸和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的趋同与不同肝毒性机制

《Journal of Hazardous Materials》：Integrated histone and proteome analyses reveal convergent and distinct hepatotoxic mechanisms of tenuazonic acid and deoxynivalenol

　　

霉菌毒素是广泛存在的膳食污染物，其健康影响预计在气候变化下会加剧。尽管它们的毒性机制尚未完全了解，但表观遗传失调越来越多地被涉及。研究人员利用基于质谱的多组学，分析了暴露于七种霉菌毒素条件下的HepG2细胞中的组蛋白翻译后修饰(hPTMs)和蛋白质组动态。时间分辨分析确定细交链孢菌酮酸(TeA)是主要的细胞干扰物，诱导H3K27和H1变体的改变，并揭示了一种先前未被识别的H1.0 N-末端甲硫氨酸氧化修饰(H1.0M0ox)，该修饰保留了蛋白质N-末端乙酰化。一种链格孢毒素混合物诱导了类似的H1反应，主要由TeA驱动，而脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)产生了趋同的染色质和蛋白质组改变。蛋白质组重塑的特征是蛋白质翻译增加，同时线粒体复合物IV表达减少，以及胆固醇生物合成受损，而杂色曲霉素(STC)激活了DNA复制和修复途径。总之，这些发现表明霉菌毒素破坏染色质组织、蛋白质合成和脂质代谢，为肝细胞功能障碍提供了毒理学见解。这些发现需要在未来假设驱动的霉菌毒素暴露研究中进行进一步验证和机制研究。

### 研究背景与问题

霉菌毒素是由真菌产生的环境污染物，广泛存在于谷物、坚果和咖啡等主食中，构成全球公共卫生和食品安全威胁。随着气候变化促进真菌增殖和产毒，其暴露水平预计进一步加剧。尽管黄曲霉毒素B₁(AFB₁)通过DNA加合物形成和TP53突变驱动肝细胞癌已被充分认识，但仅凭遗传损伤无法完全解释霉菌毒素的毒性，尤其是多种毒素共暴露的实际场景。常见霉菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、杂色曲霉素(STC)和链格孢毒素（包括细交链孢菌酮酸(TeA)、交链孢酚(AOH)和交链孢酚单甲醚(AME)）表现出肠肝毒性，但其分子机制仍不明确。越来越多的证据表明，霉菌毒素可通过诱导表观遗传失调（如组蛋白翻译后修饰(hPTMs)）发挥毒性，然而目前研究主要集中于DNA甲基化，且局限于AFB₁、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。对全局hPTM重塑的时间分辨分析，以及整合表观遗传与蛋白质组数据的研究仍然匮乏，限制了对表观遗传改变如何驱动细胞表型变化的理解。此外，现有毒性评估多聚焦于细胞毒性和遗传毒性，易忽视亚致死水平下早期的分子改变。因此，识别早期表观遗传扰动对于完善毒理学框架、理解环境污染物在表型效应发生前如何重塑细胞调控网络至关重要。

### 研究内容与结论

研究人员采用时间分辨设计（24-72小时），在HepG2细胞中研究七种常见膳食霉菌毒素（AFB₁、AME、AOH、DON、STC、TeA及链格孢毒素混合物）对肝脏表观基因组和蛋白质组的影响。通过非靶向超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，从相同样本中同时定量hPTMs和蛋白质组变化。研究发现，TeA、链格孢毒素混合物和DON是主要的染色质干扰物，其中TeA诱导了最显著的hPTM动态变化，包括H3K27和H1变体改变，并发现一种新的hPTM——H1.0 N-末端甲硫氨酸氧化修饰(H1.0M0ox)。蛋白质组分析显示，TeA和DON引起广泛的蛋白质组重塑，包括蛋白质翻译上调、线粒体复合物IV表达降低、胆固醇生物合成受损，而STC则激活了DNA复制和修复通路。这些发现揭示了霉菌毒素破坏染色质组织、蛋白质合成和脂质代谢的机制，为肝细胞功能障碍提供了毒理学见解。论文发表在《Journal of Hazardous Materials》。

### 关键技术方法

研究人员从HepG2细胞（来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)）中提取组蛋白，采用标准化的组蛋白低渗裂解缓冲液(HLB)提取方案，并通过SDS-PAGE进行质量控制。组蛋白经丙酰化、酶切和二次丙酰化后，使用ZenoTOF 7600系统耦合ACQUITY UPLC M-Class系统进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析（数据依赖采集模式）。蛋白质组样本采用S-trap^TM方案处理，酶切后通过数据非依赖采集(DIA)模式分析。hPTM数据用Progenesis QIP和Mascot预处理，统计分析使用msqrob2PTM工作流进行差异使用分析。蛋白质组数据用DIA-NN 2.1.0处理，蛋白水平统计推断使用MSqRob2。可视化及下游分析（包括火山图和热图）使用BigOmics Analytics v4.1.5，整合多种差异丰度分析方法。

### 研究结果

**3.1 亚细胞毒性暴露浓度的选择**
基于MTS衍生的剂量-反应实验（24-72小时），选择低于或接近时间依赖性IC₅₀范围的浓度，以在避免过度细胞毒性的前提下诱导可测量的细胞反应。最终浓度：AFB₁ (0.004 mM)、AME (0.037 mM)、AOH (0.19 mM)、DON (0.004 mM)、STC (0.015 mM)、TeA (0.51 mM)，链格孢毒素混合物（AOH: 0.02 mM, TeA: 0.076 mM, AME: 0.02 mM）。

**3.2 TeA和DON驱动时间依赖的肝组蛋白景观破坏**
通过时间分辨hPTM谱分析，研究人员发现TeA、链格孢毒素混合物和DON是主要的染色质干扰物。主成分分析(PCA)显示处理样本与DMSO对照随时间明显分离。TeA暴露诱导了H3K27状态（如H3.3K27me1和未修饰的H3.2K27）降低，以及组蛋白H1.X的未修饰残基（K142、K144、K145）显著减少。最显著的是，TeA导致N-末端乙酰化且起始甲硫氨酸氧化的组蛋白H1.0（H1.0N-term0acM0ox）积累，同时其加工形式（H1.0N-term1Ac）减少。该修饰在DON暴露中也观察到。蛋白质组数据独立证实了TeA诱导的氧化应激反应，金属硫蛋白2A (MT2A)是最强诱导的蛋白，铁蛋白亚基和血红素加氧酶1 (HMOX1)升高，转铁蛋白(TF)降低。链格孢毒素混合物诱导了连接组蛋白变体（H1.0, H1.4, H1.5, H1.X）的显著变化，并降低H2B水平，同时H3K14me3和H3K9me2下调，H3K23ac上调，提示染色质松弛和转录许可增加。

**3.3 TeA和DON暴露诱导广泛的蛋白质组重塑和趋同的分子特征**
从相同组蛋白样本中分析了蛋白质组（5,619种蛋白），UMAP分析显示TeA、AFB₁和DON具有最强的分离效应。TeA和DON的蛋白质组谱高度相关(r=0.64)，表明共享的分子应激通路，MT2A是共同响应者。集成机器学习方法识别出MT2A、溶质载体家族2成员3 (SLC2A3)、N-myc下游调节基因1 (NDRG1)和羧肽酶D (CPD)为区分霉菌毒素特异性应答的关键生物标志物。决策树分析进一步区分了TeA和DON：DON与低载脂蛋白B-100 (APOB)水平相关，而TeA与高APOB水平相关。

**3.4 TeA驱动翻译应激和线粒体功能障碍，与DON在胆固醇生物合成损伤上趋同**
TeA诱导了最广泛的蛋白质组重塑（1,240个差异表达蛋白），其次是AFB₁ (283)和DON (276)。基因集富集分析(GSEA)显示，TeA显著上调蛋白质翻译过程（涉及真核延伸因子和起始因子），并激活核蛋白输入和伴侣蛋白应激反应。翻译激活可能与H1.0N-termAcM0ox修饰相关，MetAP2和Naa10在TeA 72小时对比中显著受影响。H1.0N-termAcM0ox与胆固醇生物合成和线粒体电子传递/氧化磷酸化通路负相关，与翻译起始因子正相关。TeA和DON均破坏了胆固醇生物合成：TeA时间依赖性地降低CYP51A，而DON急性抑制甲羟戊酸通路多个组分（CYP51A1, LSS, HMGCS1, DHCR7），但部分在72小时恢复正常。蛋白质-蛋白质相关性分析揭示了TeA和DON暴露下脂质代谢网络的协同下调。此外，TeA还增加了组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2以及NuRD复合物组分的丰度，并与胆固醇代谢抑制相关。TeA抑制了线粒体复合物IV组装，主要影响核编码亚基和组装因子，而非线粒体基因组编码的核心亚基。

**3.5 STC诱导复制应激和G1/S检查点失败，而AFB₁靶向核糖体生物合成**
AFB₁暴露下调了核糖体相关过程（包括核糖体生物合成、rRNA代谢和ncRNA加工），提示保守的核糖体毒性靶点。STC则主要影响细胞周期调控，48小时后微小染色体维持(MCM)复合物亚基显著积累，核苷酸切除修复通路（DDB1/DDB2, XPC, RPA1/3, RFC, PCNA）强烈上调，表明G1/S检查点失效，细胞在DNA损伤情况下异常进入S期，导致基因组不稳定。添加外源性S9代谢组分进一步加剧了STC的细胞毒性，微核形成增加2.6倍，证实生物活化是STC驱动染色体不稳定的关键增强因素。

### 讨论与结论总结

讨论部分指出，TeA和DON在胆固醇生物合成抑制上趋向一致，而STC和AFB₁分别干扰复制和核糖体生物合成。研究首次报道了H1.0M0ox这一氧化相关的组蛋白加工缺陷，并将其与氧化应激和染色质-代谢串扰联系起来。TeA诱导的翻译增加与线粒体功能障碍和胆固醇合成抑制同时发生，可能反映了一种适应性反应，但需进一步验证。研究局限性包括：DMSO作为溶剂可能影响组蛋白乙酰化、蛋白质组分析需要大量数据填补、时间点可能未捕获最早的表观遗传事件、HepG2细胞系作为肝癌细胞系存在代谢和表观遗传特点，结果需在更生理相关的系统中验证。未来研究应结合低剂量暴露模型和功能性分析（如海马细胞外流量分析、氧化应激测定、嘌呤霉素掺入实验）来确认翻译变化。

研究结论翻译：本研究整合了时间分辨的hPTM和蛋白质组分析，在亚细胞毒性暴露条件下研究了HepG2细胞对霉菌毒素的细胞反应。其中，TeA、链格孢毒素混合物和DON诱导了一种新的H1.0Mox hPTM，DON和TeA主要在脂质代谢紊乱上趋同，MT2A上调反映了氧化应激。为支持透明度和可重复性，研究人员提供了交互式数据资源，用于探索时间依赖的蛋白质组和表观基因组反应，包括动态蛋白轨迹和相关性网络结构（如NuRD复合物），使该高维数据集可被更广泛的研究社区访问，并支持超越传统差异分析的通路水平解读。这些整合的、系统层面的方法强化了多组学策略在识别协调分子反应和推进机制毒理学及危害表征中的价值，但结果应在HepG2模型和亚细胞毒性暴露条件的限制下进行解释。未来工作应在低剂量暴露范式和更生理相关的系统中验证这些结果，以进一步阐明表观遗传-代谢串扰在肝功能障碍和致癌作用中的作用。