CDK4/MERCs/PINK1轴通过线粒体自噬缺陷和cGAS-STING激活驱动PFOA/HFPO-TA诱导的心脏衰老：环黄芪醇的体外改善作用

《Advanced Science》：CDK4/MERCs/PINK1 Axis Drives PFOA/HFPO-TA-Induced Cardiac Senescence via Mitophagy Defect and cGAS-STING Activation: In Vitro Amelioration by Cycloastragenol

　　

全氟和多氟烷基物质(PFAS)是普遍存在的持久性环境污染物，具有高生物蓄积潜力，并在受污染的水、土壤和生物群中带来广泛的人类暴露风险。尽管大量研究已确定PFAS的肝毒性潜力，但对其心脏毒性及潜在分子机制知之甚少。在此，研究人员研究了两种代表性PFAS——全氟辛酸(PFOA)及其替代品六氟环氧丙烷三聚体酸(HFPO-TA)的心脏毒性效应和分子通路。暴露于PFOA或HFPO-TA均导致心脏结构和功能损伤、线粒体形态异常以及心脏衰老增加，其中HFPO-TA引发更强的心脏毒性。机制上，PFOA和HFPO-TA抑制CDK4表达，使线粒体-内质网接触(MERCs)不稳定，并损害PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。这种有缺陷的线粒体自噬促进线粒体DNA泄漏及随后的cGAS-STING通路激活，最终驱动心脏衰老。值得注意的是，环黄芪醇(CAG)有效逆转CDK4下调，恢复MERCs稳定性，并在体外减轻PFOA/HFPO-TA诱导的心脏衰老。总之，本研究揭示了介导PFOA/HFPO-TA诱导心肌毒性的CDK4/MERCs/PINK1轴，并确定CAG是一种有前景的天然产物，可减轻环境污染物诱导的心脏衰老，为PFAS健康风险评估和干预策略提供了见解。

全氟和多氟烷基物质（PFAS，包括数千种合成有机氟化合物）因其疏水疏油性被广泛用于工业与消费品，但也带来环境持久性和生物蓄积问题。其中，全氟辛酸（PFOA）是典型遗留化合物，其替代品六氟环氧丙烷三聚体酸（HFPO-TA）虽被认为肝毒性较低，但心脏毒性及分子机制尚不明确。心脏依赖线粒体氧化磷酸化供能，线粒体自噬通过PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin通路清除受损线粒体，维持稳态；线粒体-内质网接触（MERCs）为PINK1定位提供空间支架。周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）除调控细胞周期外，还定位于MERCs并稳定其结构。当线粒体自噬缺陷时，线粒体DNA（mtDNA）泄漏至胞质，激活环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路，驱动细胞衰老。环黄芪醇（CAG）是黄芪的活性成分，具有抗衰老活性，但能否缓解PFAS诱导的心脏衰老未知。为此，研究人员在体内和体外模型中探究了CDK4/MERCs/PINK1轴在PFOA/HFPO-TA诱导心脏衰老中的作用，并验证CAG的保护效果。

研究人员通过体内实验（雄性ICR小鼠，灌胃7 mg/kg PFOA或0.7 mg/kg HFPO-TA，28天）和体外实验（HL-1心肌细胞系）相结合，采用组织病理学、透射电镜（TEM）、Western blot、qRT-PCR、免疫荧光、线粒体活性氧（ROS）和膜电位检测、细胞转染（CDK4过表达、cGAS敲低）、药物处理（Baf A1、H-151、CAG）及分子对接等技术，系统评估了心脏结构功能、线粒体形态、线粒体自噬、MERCs完整性、cGAS-STING通路激活及衰老标志物的变化。研究结果发表在《Advanced Science》。

**2.1 PFOA/HFPO-TA暴露诱导心脏结构和功能损伤，且HFPO-TA效力更高**：通过组织病理学（H&E染色）和心肌肌钙蛋白T（cTNT）免疫荧光发现，暴露组心脏结构紊乱、心肌细胞排列松散、炎症浸润，cTNT水平降低；qRT-PCR显示心衰标志物ANP、BNP、β-MHC上调，SERCA2a下调；TEM观察到线粒体外膜破裂、嵴损伤、空泡化，Flameng评分升高，线粒体数量减少，HFPO-TA效应更强。

**2.2 PFOA/HFPO-TA暴露诱导线粒体功能障碍、线粒体自噬受损和mtDNA积累**：MitoSOX检测显示线粒体ROS升高；Western blot发现自噬相关蛋白p62上调，Beclin1、Sirt3、SOD2、LC3-II/I比值、Parkin和PINK1下调；免疫荧光确认PINK1/Parkin荧光强度降低；qPCR分析胞质mtDNA（ND1、ND2、COX1）拷贝数增加；Western blot显示MICOS复合物组分（IMMT、ATAD3A、SAMM50、CHCHD3）及TFAM蛋白水平降低，HFPO-TA影响更显著。

**2.3 PFOA/HFPO-TA暴露激活cGAS-STING通路驱动心脏衰老**：Western blot显示cGAS、STING、PERK、eIF2α蛋白水平升高；SA-β-gal染色阳性面积增加；衰老标志物p53、p-p53、p21、p16上调，CDK4下调；qRT-PCR检测SASP因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2）mRNA升高；免疫荧光显示p21/p16阳性区扩大。cGAS敲低和STING抑制剂H-151处理分别显著降低p21/p16表达和SA-β-gal阳性率，证实cGAS-STING通路是驱动衰老的关键下游事件。

**2.4 PFOA/HFPO-TA暴露导致MERCs破坏并与心脏衰老相关**：Western blot检测MERCs锚定蛋白MFN2、FUNDC1、IP3R1下调；TEM定量分析显示MERCs覆盖面积减少、线粒体与内质网平均距离增加、接触长度缩短；免疫荧光共定位（TOM20标记线粒体，Calnexin标记内质网）显示共定位降低；相关性分析和PPI网络表明MERCs与线粒体自噬及衰老基因显著相关。

**2.5 PFOA/HFPO-TA暴露损害HL-1细胞中线粒体PINK1定位和自噬流**：细胞形态学观察显示损伤；ROS升高、线粒体膜电位（MMP）降低；荧光共定位（Mito-DsRed与PINK1抗体）显示PINK1向线粒体定位减少；自噬抑制剂Baf A1处理使p62进一步积累、LC3-II/I比值升高，表明自噬流受阻而非形成抑制；Baf A1同时加重p21、p16上调和SA-β-gal阳性率，支持线粒体自噬缺陷在衰老中的因果作用。

**2.6 CDK4作为MERCs和PINK1的上游调控因子调节PFOA/HFPO-TA诱导的衰老**：时间梯度实验（2h、6h、12h）显示CDK4下调先于MERCs破坏和SA-β-gal增加；分子对接预测PFOA和HFPO-TA与CDK4直接结合（结合自由能分别为-8.2和-10.5 kcal/mol）。CDK4过表达实验表明，恢复CDK4水平可显著恢复MERCs完整性（TOM20-Calnexin共定位）、PINK1线粒体定位、自噬流（p62降低、LC3-II/I比值升高），并抑制cGAS-STING通路激活及p21、p16和SASP因子上调，最终减轻SA-β-gal阳性。

**2.7 CAG与CDK4结合并恢复MERCs稳定性以缓解PFOA/HFPO-TA诱导的衰老**：分子对接显示CAG与CDK4稳定结合；Western blot和免疫荧光证实CAG恢复CDK4表达；CAG处理恢复MERCs完整性（共定位增加），降低ROS，减少SA-β-gal阳性面积，下调p21、p16及SASP因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL2）mRNA水平。

**讨论与结论**：本研究首次揭示CDK4/MERCs/PINK1轴是PFOA/HFPO-TA心脏毒性的核心机制：暴露物抑制CDK4，破坏MERCs，阻遏PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，导致mtDNA泄漏激活cGAS-STING通路，最终驱动心脏衰老；HFPO-TA因对该轴抑制更强而毒性更高。CAG通过恢复CDK4表达和MERCs稳定，有效逆转这一毒性级联。研究还发现HFPO-TA的更强心脏毒性与其对CDK4/MERCs/PINK1轴更严重的破坏一致，且cGAS-STING通路是差异毒性的关键介质。同时，Sirt3-SOD2抗氧化轴的抑制加剧了线粒体ROS产生，与线粒体自噬缺陷协同促进损伤。研究存在局限性：所用剂量高于典型人暴露水平，仅验证了雄性小鼠，CAG保护作用仅限体外。未来需在环境相关低剂量、雌性模型和体内长期干预中进一步验证。结论：本研究表明PFOA及其工业替代品HFPO-TA通过CDK4/MERCs/PINK1轴诱导心脏衰老。PFOA/HFPO-TA暴露抑制CDK4表达，使MERCs不稳定，损害PINK1线粒体招募和线粒体自噬功能，触发mtDNA泄漏及随后的cGAS-STING通路激活，最终驱动心脏衰老，其中HFPO-TA作用更强。CAG通过恢复CDK4表达、稳定MERCs并拯救整个线粒体自噬-衰老调控网络，在体外改善PFOA/HFPO-TA诱导的心脏衰老。这些发现将CDK4确定为PFAS相关心脏毒性的潜在分子生物标志物和治疗靶点，并强调CAG是一种有前景的天然产物，可用于减轻污染物诱导的心脏衰老。总之，本研究填补了理解PFAS诱导心脏损伤分子机制的关键空白，为PFAS替代品的综合环境健康风险评估以及针对污染物诱导器官衰老的有效干预策略开发提供了重要见解。