SRPK3通过调节KLF3-mTOR/P70 S6K介导的自噬加重心肌缺血/再灌注损伤

《Acta Pharmacologica Sinica》：SRPK3 exacerbates cardiac ischemia/reperfusion injury by regulating KLF3-mTOR/P70 S6K-mediated autophagy

　　

心肌缺血再灌注（I/R）损伤仍是全球范围内心功能障碍和死亡的主要原因。丝氨酸/精氨酸富集蛋白激酶3（SRPK3）在心肌中高表达，但其在I/R损伤中的特定病理作用尚未完全阐明。研究人员利用心肌特异性基因敲除小鼠模型和心肌细胞缺氧/复氧实验，研究了SRPK3的功能。结果表明，SRPK3缺失显著保护了心脏功能，减少了梗死面积，并减轻了细胞凋亡和氧化应激。相反，SRPK3过表达则加重了这些病理表型。在机制上，通过整合转录组学、磷酸化蛋白质组学和定点诱变技术，研究人员揭示SRPK3直接磷酸化转录因子KLF3的Ser71残基。该磷酸化事件破坏了KLF3介导的mTOR转录激活，从而抑制了mTOR/P70 S6K信号轴。这一抑制进而释放了过度、适应不良的自噬流，使其从稳态机制转变为致死过程，进一步加重了心肌损伤。综上，研究人员系统阐明了SRPK3通过KLF3-mTOR轴诱导致死性自噬，从而作为心肌I/R损伤中的有害调节因子发挥作用。这些发现将SRPK3-KLF3相互作用确定为关键分子开关，并为管理缺血性心脏病提供了有前景的治疗靶点。

**论文解读：SRPK3通过磷酸化KLF3抑制mTOR/P70 S6K信号轴驱动致死性自噬加重心肌缺血再灌注损伤**

**研究背景与问题**
缺血性心脏病（IHD）是全球主要死亡原因之一，给患者和社会带来沉重经济负担。尽管及时恢复冠状动脉血运可挽救缺血区心肌细胞，但会引发心肌缺血再灌注（I/R）损伤——一种继发性心脏损伤，目前仍是心血管疾病患者死亡的重要因素。此外，除直接缺血诱导的心肌损伤外，长期缺氧还可导致心肌重构，严重影响患者预后。然而，I/R损伤目前缺乏有效治疗手段。自噬在缺血/再灌注（IR）反应中具有关键作用，通过清除受损线粒体与蛋白质来减少氧化应激（OS）和细胞死亡，但过度或失调的自噬可诱导自噬性细胞死亡，加重心肌损伤与重构。丝氨酸/精氨酸富集蛋白激酶3（SRPK3）在心肌中高表达，先前研究发现其参与RNA剪接和肌肉生物学，但SRPK3在心脏I/R损伤中的具体病理作用及分子机制尚不明确。Kruppel样因子3（KLF3）是KLF家族成员，可调控细胞功能与组织发育，但磷酸化KLF3在缺血性心肌病（ICM）中的角色仍不清楚。因此，研究人员旨在阐明SRPK3在心肌I/R损伤中的功能及其下游信号机制。

**研究内容与结论**
研究人员通过构建心肌特异性SRPK3过表达（SRPK3 cTg）和敲除（SRPK3 cKO）小鼠模型，结合体内I/R手术、体外心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型，以及转录组学、4D无标记蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、定点诱变、免疫共沉淀（Co-IP）等技术，系统揭示了SRPK3在I/R损伤中的有害作用及其分子机制。结论如下：SRPK3在I/R损伤后心肌细胞中显著上调，其过表达加重心肌梗死面积、心肌损伤标志物（cTnT、CK-MB）、细胞凋亡、氧化应激及心脏功能障碍，并促进晚期心肌重构；而SRPK3敲除则显著减轻上述损伤。机制上，SRPK3直接结合并磷酸化KLF3的Ser71残基，磷酸化的KLF3抑制mTOR转录活性，进而抑制mTOR/P70 S6K信号通路，导致过度且适应不良的自噬流激活，将自噬从保护性稳态转变为致死性过程，最终加重心肌细胞凋亡、氧化应激和心脏功能恶化。研究还发现，KLF3 Ser71位点突变（S71A）可逆转SRPK3过表达引起的自噬增强、凋亡和心功能损伤，证实该位点是SRPK3-KLF3-mTOR轴的关键分子开关。该论文发表在《Acta Pharmacologica Sinica》。

**主要关键技术与方法**
1. 基因编辑小鼠模型：利用CRISPR/Cas9系统构建SRPK3^fl/fl小鼠，与α-MHC-Cre或α-MHC-MerCreMer转基因小鼠杂交，获得心肌特异性SRPK3过表达（SRPK3 cTg）和敲除（SRPK3 cKO）小鼠（来源：上海模式生物中心、赛业生物）。
2. 多组学分析：对I/R后24小时经Langendorff逆行灌流分离的心肌细胞进行4D无标记蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析，结合转录组学，鉴定差异表达蛋白（DEPs）与磷酸化位点。
3. 定点诱变与功能验证：构建KLF3野生型（WT）、磷酸化缺陷型（S71A）和磷酸化模拟型（S71D）腺病毒载体，在HL-1细胞或HEK293T细胞中联合SRPK3过表达处理，检测mTOR/P70 S6K信号及自噬标志物（LC3-II/I比值、P62）。
4. 体内基因干预：通过尾静脉注射AAV9-KLF3-S71A，在SRPK3 cTg小鼠I/R模型中评估其对心肌损伤、凋亡、氧化应激及心脏功能的影响。
5. 样本队列来源：人类心脏样本来自武汉大学人民医院伦理委员会批准的终末期心力衰竭患者（ICM病因）及健康供体左心室组织。

**研究结果**
**SRPK3在心肌细胞中的上调与I/R发病机制相关**
单细胞转录组分析显示SRPK3是心肌细胞（CMs）特异性激酶，在人类心脏组织中主要表达于CMs。I/R小鼠模型和缺血性心肌病（ICM）患者心肌组织中SRPK3蛋白水平显著升高，且在梗死边缘区上调。体外H/R处理的原代新生大鼠心肌细胞（NRCMs）中SRPK3表达增强。

**心肌细胞SRPK3过表达加重I/R早期损伤和晚期心肌重构**
SRPK3 cTg小鼠在I/R后24小时血浆cTnT和CK-MB显著升高，梗死面积增大，心肌细胞空泡化加剧，TUNEL阳性凋亡细胞增加，DHE和4-HNE染色显示氧化应激增强。I/R后4周，SRPK3 cTg小鼠心肌细胞横截面积增加，肥大标志物（Anp、Bnp）上调，Myh6转录紊乱，超声心动图显示左心室射血分数（LVEF）和整体纵向应变（GLS）降低，压力-容积（PV）曲线左移，左心室收缩末期容积（LVESV）和舒张末期容积（LVEDV）增加，提示心功能恶化。

**心肌细胞特异性敲除SRPK3减轻I/R后急性心肌损伤和晚期重构**
SRPK3 cKO小鼠在I/R后24小时血清cTnT和CK-MB降低，梗死面积减小，心肌细胞空泡化减轻，凋亡和氧化应激水平下降。I/R后4周，心肌细胞肥大减轻，LVEF和GLS改善，PV曲线右移，LVESV和LVEDV降低，提示左心室顺应性改善。

**SRPK3通过mTOR/P70 S6K信号通路促进缺血缺氧诱导的急性反应**
蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学联合分析显示，SRPK3敲除后差异表达蛋白（DEPs）富集于自噬相关通路。时间进程分析表明，SRPK3蛋白水平在I/R后6小时开始下降，24小时达最低，与自噬标志物LC3-II降低和P62积累同步。mTOR信号磷酸化抗体阵列显示，SRPK3敲除促进mTOR关键激活位点（S1261、S739、S540）和S6K的磷酸化。在HEK293T细胞中，SRPK3过表达抑制p-mTOR和p-P70 S6K表达，增加LC3-II/I比值并降低P62，自噬流增强；SRPK3敲低则相反。

**SRPK3在心肌缺血再灌注早期磷酸化KLF3的Ser71位点**
Co-IP实验证实SRPK3与KLF3直接相互作用。蛋白质组学分析发现SRPK3敲除后KLF3蛋白水平下降，但mRNA水平无显著变化，提示SRPK3通过翻译后修饰调控KLF3。磷酸化位点分析显示KLF3 Ser71位点磷酸化水平在SRPK3过表达时升高，敲低时降低。S71A突变体与SRPK3的结合能力显著低于野生型KLF3。在hiPSC-CMs中，SRPK3抑制减少p-KLF3 Ser71的核积累。

**SRPK3-KLF3 Ser71影响mTOR/P70 S6K信号通路**
KLF3敲低下调SRPK3表达，而KLF3过表达无影响，提示KLF3单向调控SRPK3。SRPK3过表达降低mTOR mRNA水平，该效应被KLF3敲低或S71A突变逆转。BafA1实验证实SRPK3过表达增强完整自噬流。在HL-1细胞中，S71A突变减弱SRPK3过表达引起的p-mTOR和p-P70 S6K下降及LC3-II/I升高、P62降低，而S71D突变模拟SRPK3效应。

**KLF3 Ser71位点突变可减轻SRPK3诱导的I/R损伤**
在SRPK3 cTg小鼠中，AAV9-KLF3-S71A处理显著降低心肌凋亡标志物（Bax/Bcl-2比值）、cTnT和CK-MB水平，缩小梗死面积，减轻TUNEL阳性和DHE染色，改善I/R后4周的LVEF、LVDd和IVSd，抑制心肌细胞肥大和自噬体形成（透射电镜），并减少早期和晚期凋亡（流式细胞术）。

**讨论与结论**
研究人员系统阐明了SRPK3在心肌I/R损伤中的双重角色：作为心肌损伤的驱动因子和自噬失衡的关键调节因子。SRPK3通过磷酸化KLF3 Ser71位点，抑制mTOR/P70 S6K信号轴，释放过度致死性自噬流，加重细胞凋亡和氧化应激，最终导致心脏功能恶化。该研究首次将KLF3与心肌损伤联系起来，并揭示了SRPK3非经典剪接激酶功能，即作为信号调节因子驱动致死性自噬。临床层面，SRPK3-KLF3-mTOR轴为心肌I/R损伤提供了潜在治疗靶点，靶向SRPK3或阻断KLF3磷酸化有望恢复自噬稳态。研究结论：SRPK3通过磷酸化KLF3促进致死性mTOR介导的自噬，从而加重心肌I/R损伤，该信号轴可作为心脏保护的新靶点。