TRF2通过调控CSNK2A2定位和FUNDC1去磷酸化恢复衰老心肌细胞中的缺血后处理心脏保护

《Aging Cell》：TRF2 Recovers Ischemic Postconditioning Cardioprotection in Aged Myocardiocytes by Regulating CSNK2A2 Localization and FUNDC1 Dephosphorylation

　　

缺血后处理（I/Post）是通过激活内源性心脏保护通路来减轻缺血/再灌注损伤的有效干预措施，但在老年患者中效果不佳，其机制尚需进一步研究。本研究发现，雄性老年小鼠（18月龄）心肌端粒重复结合因子2（TRF2）蛋白表达低于雄性成年小鼠（4月龄）。在结扎心脏前降支建立缺血/再灌注损伤体内模型后，研究人员发现I/Post后TRF2表达进一步下降。为探究TRF2在衰老心脏I/Post心脏保护中的作用，研究人员在向老年小鼠注射过表达TRF2的腺相关病毒9型后，进行了超声心动图、血液生化检测和凋亡相关检测，发现TRF2在体内改善了心肌I/Post保护。在心肌细胞系（HL-1）中敲低TRF2，增加了衰老心肌细胞在缺氧后处理（H/Post）后炎症因子的释放，加剧了线粒体和DNA损伤。TRF2还通过增加衰老心肌细胞H/Post期间的线粒体自噬，抑制了cGAS/STING通路的激活。此外，TRF2与酪蛋白激酶2α2多肽（CSNK2A2）相互作用，调节含FUN14结构域蛋白1（FUNDC1）的去磷酸化，这有助于缺氧后处理的保护作用。

**论文解读**

**研究背景与问题**

心肌梗死发病率逐年上升，高龄是缺血性心脏病的独立不良预后因素。及时恢复冠状动脉血流（如经皮冠状动脉介入治疗）可增强心肌灌注，但再灌注可能加剧心肌损伤，即缺血/再灌注（I/R）损伤。与年轻患者相比，老年患者心肌梗死面积更大、心肌挽救能力降低、心肌水肿程度增加。缺血后处理（I/Post）通过在长时间缺血后、完全再灌注前进行反复短暂再灌注，激活内源性保护通路，可显著减轻缺血组织损伤。然而，I/Post在衰老心脏中可能失去保护作用，其潜在机制尚不明确，需要探索减轻老年患者心肌I/R损伤的新治疗策略。

端粒是由TTAGGG DNA串联重复序列和 shelterin 复合物组成的DNA-蛋白质复合物，被认为是细胞衰老的生物钟。端粒缩短是衰老发生的关键生物标志物。临床研究表明白细胞端粒长度较短与缺血性心脏病风险升高相关。端粒酶活性也与衰老和心肌损伤有关。端粒重复结合因子2（TRF2）是shelterin复合物的组成成分，特异性结合端粒双链DNA，其缺失或突变可导致DNA损伤和端粒缩短，引起复制性衰老。在原发性心肌细胞中，敲低TRF2导致端粒缩短和细胞衰老，而过表达TRF2可减轻过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激损伤并维持端粒长度。然而，TRF2在衰老心肌细胞缺血/再灌注损伤中的潜在作用尚未阐明。

衰老、线粒体功能障碍和炎症在I/R损伤中形成恶性循环，cGAS-STING通路是这些因素之间关系的重要驱动因素。但关于TRF2在衰老、心肌I/Post损伤与cGAS-STING通路关系中的作用研究较少。因此，本研究旨在确定TRF2是否对衰老心脏心肌I/Post损伤提供保护，并探究cGAS-STING通路是否参与该保护作用。

**主要技术方法**

研究人员采用雄性C57BL/6小鼠（4月龄成年和18月龄老年）建立心肌缺血/再灌注（I/R）及缺血后处理（I/Post）体内模型，通过尾静脉注射腺相关病毒9型（AAV9）过表达TRF2。体外实验使用HL-1心肌细胞系，以H₂O₂诱导衰老并建立缺氧/复氧（H/R）及缺氧后处理（H/Post）模型。采用超声心动图、ELISA、TUNEL染色、流式细胞术、免疫印迹、免疫荧光、免疫沉淀、线粒体与溶酶体共定位染色、JC-1探针、电子显微镜、qRT-PCR等检测心功能、心肌损伤标志物、凋亡、线粒体自噬、cGAS/STING通路激活及蛋白质相互作用。

**研究结果**

**3.1 老年小鼠I/Post损伤加重与TRF2表达降低相关**
通过超声心动图、ELISA、qRT-PCR、TUNEL染色和免疫组化发现，与成年小鼠相比，老年小鼠在I/Post后左心室射血分数（LVEF%）和缩短分数（FS%）显著降低，心肌酶CK-MB和炎症因子IL-6浓度升高，TERT mRNA水平及端粒长度降低，心肌凋亡增加，TRF2蛋白表达降低。表明老年小鼠I/Post后损伤加重与TRF2表达下降有关。

**3.2 TRF2过表达减轻老年小鼠I/Post损伤**
通过AAV9尾静脉注射过表达TRF2后，Western blot和免疫组化验证TRF2蛋白显著增加。与对照组相比，过表达TRF2组老年小鼠I/Post后P53蛋白表达降低，Bcl-2/Bax比值升高，TUNEL阳性心肌凋亡比例降低，CK-MB和IL-6浓度降低，LVEF%和FS%升高。表明TRF2过表达可改善老年心脏I/Post损伤。

**3.3 衰老心肌细胞H/Post未能改善H/R损伤与TRF2表达降低相关**
用H₂O₂处理HL-1细胞建立衰老模型，CCK-8、qRT-PCR、SA-β-gal染色和Western blot显示，随着H₂O₂浓度升高，细胞活力下降，TERT mRNA和端粒长度降低，衰老细胞比例增加，TRF2蛋白表达降低，P53升高，Bcl-2/Bax降低。在H/Post实验中，正常心肌细胞H/Post后Bcl-2/Bax和TRF2表达高于H/R，而衰老心肌细胞则无显著差异，表明H/Post对衰老心肌细胞H/R损伤的保护失败与TRF2表达降低有关。

**3.4 敲低TRF2增加衰老心肌细胞H/Post期间的DNA损伤、炎症因子释放和线粒体损伤**
在衰老HL-1细胞中敲低TRF2并进行H/Post后，Western blot显示Bcl-2/Bax降低，IL-6升高，线粒体功能相关蛋白SIRT1和PCG-1α降低；流式细胞术显示凋亡比例增加；线粒体追踪染色显示线粒体损伤加剧；免疫荧光显示γ-H2AX核染色增加（DNA损伤增大）；JC-1探针显示线粒体膜电位下降；SA-β-gal染色显示衰老细胞比例增加；TERT mRNA和端粒长度进一步缩短。表明TRF2敲低加剧了衰老心肌细胞H/Post后的损伤。

**3.5 TRF2通过促进线粒体自噬抑制H/Post后cGAS/STING通路激活**
在衰老心肌细胞H/Post后，Western blot显示LC3BII/I比值降低、P62升高（线粒体自噬受损），cGAS、STING和p-NF-κB蛋白表达升高。过表达TRF2后可增加线粒体自噬水平，抑制cGAS/STING通路和p-NF-κB表达。线粒体-溶酶体免疫荧光共定位和电子显微镜证实，正常心肌细胞H/Post后线粒体自噬增强，而衰老心肌细胞自噬受阻，线粒体膜破裂；过表达TRF2可恢复线粒体自噬。此外，溴化乙锭（EtBr）抑制线粒体DNA（mtDNA）释放可减少cGAS/STING激活，而TRF2敲低取消该保护效应。

**3.6 TRF2与CSNK2A2相互作用调控FUNDC1磷酸化水平**
通过BioGRID预测和相互作用筛选，发现TRF2的潜在互作蛋白为酪蛋白激酶2α2多肽（CSNK2A2）。在HL-1细胞中过表达TRF2后，CSNK2A2蛋白表达降低，FUNDC1蛋白表达升高，但p-FUNDC1^ser17降低；敲低TRF2则相反。内源性免疫沉淀和外源性共转染Flag-TRF2与Myc-CSNK2A2验证了TRF2与CSNK2A2的相互作用。细胞免疫荧光显示过表达TRF2使CSNK2A2在核内增多，敲低则减少。核质分离和线粒体蛋白提取后Western blot显示TRF2影响CSNK2A2的分布，并增加FUNDC1蛋白表达但降低其磷酸化水平。

**3.7 TRF2通过调控CSNK2A2/FUNDC1改善衰老心肌细胞H/Post损伤**
过表达CSNK2A2后，FUNDC1和p-FUNDC1蛋白表达升高，在衰老心肌细胞H/Post后Bcl-2/Bax降低、线粒体自噬下降、cGAS/STING通路和p-NF-κB激活，而共转染TRF2可改善上述变化。将FUNDC1第17位丝氨酸突变为丙氨酸（FUNDC1^ser17A）模拟去磷酸化，过表达FUNDC1^ser17A可激活线粒体自噬、抑制cGAS/STING通路和p-NF-κB、减轻H/Post损伤，而敲低TRF2则取消该保护作用。

**总结与讨论**

本研究揭示了TRF2在衰老心肌细胞缺血后处理保护中的关键作用。TRF2蛋白表达在老年小鼠中降低，I/Post后进一步下降；过表达TRF2可减轻老年小鼠I/Post损伤。衰老心肌细胞H/Post无法发挥保护作用与TRF2表达降低、线粒体自噬抑制及cGAS/STING通路激活有关。TRF2通过与CSNK2A2相互作用，减少FUNDC1的磷酸化，从而激活线粒体自噬，抑制cGAS/STING通路和炎症反应，最终减轻衰老心肌细胞I/Post损伤。研究结论：TRF2通过调控CSNK2A2定位和FUNDC1去磷酸化，恢复衰老心肌细胞中的缺血后处理心脏保护，为改善老年患者心肌I/R损伤提供了潜在靶点和通路。