PrPC限制APP向质膜递送并改变其加工以促进Aβ释放

《Neurobiology of Disease》：PrPC limits APP delivery to the plasma membrane and alters its processing to facilitate aβ release

　　

多项证据表明细胞型朊蛋白（PrPC）在阿尔茨海默病（AD）中发挥一种或多种作用。研究人员既往在表达携带瑞典突变人APP（APPswe）的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中观察到，PrPC表达与Aβ42肽分泌相关，而Aβ42是由淀粉样前体蛋白（APP）蛋白水解加工产生并居于AD核心地位的产物。为明确PrPC是否调控APP加工从而影响Aβ42释放，以及该效应是否仅选择性作用于APPswe，研究人员应用MesoScale Discovery（MSD）平台，在APPswe与野生型APP（APPwt）N2a细胞中，于siRNA诱导敲低PrPC前后评估APP加工与Aβ分泌。研究人员发现，在APP表达未降低且Aβ降解未增强的情况下，PrPC敲低使两株细胞主要分泌型Aβ亚型（N2a-APPwt细胞中Aβ42除外）均减少。此外，两株细胞中β-分泌酶切割的可溶性胞外域（sAPPβ）降低，而α-分泌酶切割胞外域（sAPPα）仅在N2a-APPwt细胞中升高。PrPC过表达在HEK细胞中提升Aβ42，在表达APPswe的N2a与HEK细胞中提升sAPPβ，证实PrPC促进淀粉样生成通路且不依赖细胞类型。N2a细胞中的生物素化与免疫荧光研究显示，PrPC敲低后质膜APP标记增加、APP内吞增强、APP C端片段（CTFs）蓄积。研究人员提出，PrPC限制APP向质膜递送，从而通过增加其在早期分泌区室对BACE1的暴露来促进淀粉样生成通路。

研究背景与立项依据：多种神经退行性疾病共享蛋白质错误折叠聚集机制，其中细胞型朊蛋白（PrP^C）作为朊病毒病核心蛋白，亦被证实可与阿尔茨海默病（AD）中Aβ寡聚体高亲和力结合，并作为毒性Aβ₄₂寡聚体 obligatory receptor 介导突触可塑性损害。既往研究对PrP^C在AD中的角色存在分歧：Parkin等认为PrP^C于脂筏抑制BACE1从而抑Aβ生成；而后续研究提示PrP^C影响APP加工可不依赖BACE1。研究人员前期在N2a-APPswe细胞及TgAD小鼠中发现PrP^C表达与Aβ₄₂水平正相关，但未阐明其是否直接调控APP加工。本研究据此在《Neurobiology of Disease》发表，旨在明确PrP^C是否经调控APP转运与加工促进Aβ释放。

主要技术方法概述：研究使用稳定表达人APPwt或APPswe的小鼠N2a细胞系，以及稳定表达对应APP的人源HEK-293细胞系（HEK-APPwt/APPswe）作为样本体系；通过siRNA敲低PrP^C（约80%）及质粒过表达PrP^C进行双向干预；采用MesoScale Discovery（MSD）电致化学发光平台与特异性ELISA定量培养基中Aβ_38/40/42、sAPPα、sAPPβ；以qRT-PCR与Western blot检测APPmRNA及全长蛋白稳态；利用表面生物素化（sulfo-NHS-SS-biotin）联合TAPI-2（ADAM10抑制剂）处理评估质膜APP水平与内吞；以非透膜与透膜免疫荧光（NTH452/CTM1/SAF32）半定量质膜及总APP分布；Western blot以Y188、6E10、P2–1等抗体分辨α-CTF、β-CTF及全长APP。

研究结果：

PrP^C KD decreases steady-state levels of secreted Aβ in N2a-APPwt and N2a-APPswe cells：MSD定量显示，PrP^C敲低约80%时，N2a-APPwt细胞Aβ₃₈降约85%、Aβ₄₀降约48%、Aβ₄₂无统计显著；N2a-APPswe细胞Aβ₄₂降约25%、Aβ_38/40降约20%，证实PrP^C缺失普遍降低Aβ分泌而非某亚型特异。

PrP^C KD does not affect mRNA or protein levels of APP in N2a-APPwt and N2a-APPswe cells：qRT-PCR与WB表明PrP^C KD后APP mRNA及全长APP蛋白量不变，排除APP表达下调导致Aβ减少。

PrP^C KD does not affect Aβ₄₀ or Aβ₄₂ degradation：外源合成Aβ_40/42加入条件培养基孵育后，敲低组与对照组降解率无差异，排除胞外降解增强。

PrP^C KD decreases steady-state levels of secreted sAPPβ in N2a-APPwt and N2a-APPswe cells, while sAPPα levels increase significantly only in N2a-APPwt cells：MSD/ELISA显示两株sAPPβ均显著下降（APPwt约16%、APPswe约21%），sAPPα仅APPwt升高约50%，提示PrP^C主要促进β-分泌酶通路而非抑制α-分泌酶。

PrP^C KD increases α-CTF levels in N2a-APPwt and N2a-APPswe cells：Y188 WB显示α-CTF在两株均升高，β-CTF未降，提示胞内CTF稳定性与分泌型ectodomain解偶联。

PrP^C KD increases APP labeling at the plasma membrane in N2a-APPwt and N2a-APPswe cells：非透膜免疫荧光见质膜APP信号增强、PrP^C信号减弱。

PrP^C KD increases CTM1-labeled total APP in N2a-APPwt and N2a-APPswe cells：透膜后CTM1积分密度升高，反映总APP（含CTF）蓄积，但P2–1 WB确认全长APP量未变，故增量来自CTF池。

PrP^C KD increases full-length APP at the surface in N2a-APPswe and N2a-APPwt cells without globally increasing surface membrane proteins：表面生物素化（TAPI-2预处理）示质膜FL-APP升约2倍（APPwt）与1.7倍（APPswe）；加37℃ 15分钟内吞追踪显示内吞APP分数亦升，说明是递送增强而非周转减慢；总生物素化膜蛋白谱无普遍增加，NCAM1（BACE1另一底物）膜量不变，BACE1蛋白量不变，证明效应相对APP特异且非BACE1活性间接上调。

PrP^C KD decreases steady-state levels of secreted Aβ in HEK-APPswe and HEK-APPwt cells：在人PrP^C背景下KD使HEK-APPwt Aβ₄₂降63%、HEK-APPswe降80%，Aβ₄₀仅APPswe显著降，跨细胞系复现。

Overexpression of PrP^C increases steady-state levels of secreted Aβ in HEK and N2a cells expressing either APPwt or APPswe：HEK-APPswe过表达PrP^C使Aβ₄₂升4倍、Aβ₄₀升；N2a-APPswe中Aβ₄₀升1.9倍；N2a-APPwt Aβ₄₀略降，双向操作印证因果关系。

PrP^C KD and overexpression reciprocally alter steady-state levels of sAPPβ in HEK and N2a cells expressing APP：HEK/N2a中KD降sAPPβ、OE升sAPPβ（N2a-APPswe升2.7倍），与Aβ变化一致。

Effect of PrP^C KD and overexpression on β-CTF in HEK-APPwt and HEK-APPswe cells：Y188/6E10 WB示HEK-APPswe中KD显著降低β-CTF、OE显著升高，APPwt趋势同但KD未达显著，进一步锚定淀粉样通路。

讨论与结论翻译：近年研究关注PrP^C兼作Aβ寡聚体受体与毒性信号蛋白的角色，亦有报道PrP^C结合BACE1前域抑制其转运切割，或老年小鼠中PrP^C缺失反减斑块。本研究用MSD高精度复现PrP^C与Aβ释放正相关，并扩展至APPwt，揭示PrP^C通过抑制APP向质膜递送，使其在分泌早期区室更多暴露于BACE1，从而促进β-分泌酶切割与Aβ生成；该效应不依细胞类型、不依APP突变、不改变APP总量与BACE1量。结论为：PrP^C limits delivery of APP to the plasma membrane, which acts to promote the amyloidogenic pathway by increasing its exposure to BACE1 within early secretory compartments（PrP^C限制APP向质膜递送，通过增加其在早期分泌区室对BACE1的暴露而促进淀粉样生成通路）。该研究将PrP^C功能从“胞外Aβ受体”上游推至“APP转运调控者”，为AD中PrP^C靶向干预提供了加工通路层面的机制依据。