《Ecology and Evolution》：Phylogeography of the Grassland Skipper Ochlodes venatus Supports the Hypothesis That This Japanese Grassland Insect Has a Long History
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在气候温暖湿润的日本，草地生态系统的保护价值常被低估，因为人们认为它们主要依赖人类活动维持。因此，了解草地生物最初于何时迁入日本并持续存在至今，对于理解日本草地生态系统的历史至关重要。本研究利用MIG-seq技术获得的基因组-wide单核苷酸多态性（SNP）以
在气候温暖湿润的日本，草地生态系统的保护价值常被低估，因为人们认为它们主要依赖人类活动维持。因此，了解草地生物最初于何时迁入日本并持续存在至今，对于理解日本草地生态系统的历史至关重要。本研究利用MIG-seq技术获得的基因组-wide单核苷酸多态性（SNP）以及线粒体DNA，对分布于日本和俄罗斯东部的草地弄蝶Ochlodes venatus（鳞翅目：弄蝶科）开展了谱系地理学研究。遗传分析显示，日本北部和西部的O. venatus类群于150万年前发生分化，并在约10万年前发生杂交。研究还发现，O. venatus种群在日本至少已持续存在20万年。在日本境内推断的长期种群历史明显长于此前研究对其他草地昆虫的估算结果。结果表明，这种草地蝶类在人类迁入日本之前很久便已存在，且日本草地是在长期自然作用下维持的，这凸显了O. venatus在日本的保护价值。
**论文解读：草地弄蝶Ochlodes venatus的谱系地理学揭示日本草地生态系统的古老历史**
**研究背景与科学问题**
日本的温暖湿润气候使得其大多数地区的顶级植被被认为是森林，因此草地生态系统长期被视为主要由人类活动（如刈割、放牧和火烧）维持的半自然生态系统，其保护价值在学术与政策层面均未得到充分重视。然而，若草地生物在人类抵达之前便已存在于日本列岛，则意味着草地生态系统可能是日本自然遗产的固有组成部分，而非仅仅依赖人为干扰。现有考古与遗传学证据表明，人类首次迁入日本约在3.2万至3.8万年前，但此前对日本草地昆虫的谱系地理研究较少，且已报道的几种草地昆虫（如绢粉蝶Aporia hippia和网蛱蝶Melitaea ambigua）与大陆类群的分化时间仅约7万至8万年，远晚于末次间冰期。因此，日本草地昆虫是否具有更古老的演化历史，以及草地生态系统在温暖湿润的间冰期能否自然维持，仍是悬而未决的科学问题。为解决这一疑问，研究人员选择日本半自然草地中分布较广但部分地区已濒危的弄蝶科物种——Ochlodes venatus作为研究对象，通过解析其谱系地理结构，推断其在日本列岛的历史起源与持续存在时间，从而检验日本草地生态系统是否早于人类活动而自然存在。
**研究设计与技术方法**
研究人员共采集了日本18个地点57头O. venatus个体及俄罗斯大陆和萨哈林岛8个地点11头个体，样本涵盖日本北海道、本州岛及俄罗斯远东地区。由于部分样本在形态上难以区分，研究结合线粒体DNA和核基因组数据进行了物种鉴定。关键技术方法包括：（1）线粒体COI基因（667 bp）测序与最大似然（ML）系统发育分析，使用IQ-Tree软件构建系统树；（2）MIG-seq（multiplexed ISSR genotyping by sequencing）技术获得全基因组范围的单核苷酸多态性（SNP），共筛选出3226个SNP用于群体遗传分析；（3）基于SNP数据进行主成分分析（PCA）、NeighborNet网络分析和Admixture聚类分析，评估遗传结构与空间格局；（4）利用DIYABC-RF（approximate Bayesian computation with random forest）进行群体历史推断，比较11种分歧与基因流情景，估算分化时间、种群有效大小和杂交事件。所有分析均以1年一代作为O. venatus的代时假设。
**主要研究结果**
**3.1 基于线粒体DNA序列的系统发育**
对来自26个地点68个样本及GenBank中9个样本的COI序列构建系统发育树，发现O. venatus构成一个支持度较高的单系群（UB=92%，SH-aLRT=96.6%），包含日本、中国和俄罗斯东部大陆的个体。O. sylvanus的支系同样获得支持（UB=100%，SH-aLRT=99.3%）。值得注意的是，萨哈林岛两个经核基因组MIG-seq鉴定为O. venatus的个体，其线粒体COI序列却归入O. similis支系，提示可能发生过渐渗杂交。O. venatus支系内部共检测到10种单倍型，个体间COI序列差异仅1–3 bp，无法基于线粒体DNA估算支系间的分化时间。
**3.2 基于MIG-seq的物种鉴定与遗传多样性**
通过MIG-seq获得3226个SNP（缺失率11.14%）。NeighborNet网络和PCA分析一致显示，来自俄罗斯大陆的R03和R05个体（携带O. sylvanus线粒体单倍型）形成独立分支，被鉴定为O. sylvanus；R08个体（携带O. similis单倍型）形成另一独立分支，被鉴定为O. similis；而携带O. venatus单倍型的俄罗斯大陆个体（R07及R08中的一部分）与日本及萨哈林岛种群高度分化。萨哈林岛两个携带O. similis线粒体单倍型的个体，其核基因SNP却与北海道O. venatus种群聚为一类，因此被最终鉴定为O. venatus，并推测其线粒体基因组在历史上因与O. similis杂交而被替换。日本各采样点O. venatus的观测杂合度（H
O）为0.040–0.055，期望杂合度（H
S）为0.060–0.085，表明其遗传多样性处于中等水平。
**3.3 岛屿种群的空间遗传结构**
Mantel检验显示，日本与萨哈林岛种群间的地理距离与共显性基因型距离呈显著正相关（p<0.001）。PCA和NeighborNet分析将日本种群划分为四个地理群：北海道群、东北群、中部群和中国地方群。Admixture分析在K=2时获得最低交叉验证误差，将种群分为北部簇（北海道与萨哈林岛）和西部簇（中国地方与中部），而东北地区的个体在两个簇中均有分布，呈现杂交特征。
**3.4 基于MIG-seq的种群历史推断**
DIYABC-RF分析比较了11个情景，发现情景10（假设中部种群为东北群与中国地方群祖先谱系杂交而成）获得最高支持（分类投票68.6%，后验概率PP=0.830）。参数估计表明，中国地方群祖先谱系与其他种群祖先谱系最早分化，时间约为156万年前（95% CI: 0.94–1.97 Mya），处于早更新世；随后北海道与东北群谱系在23万年前（95% CI: 0.10–0.36 Mya）分化；中部种群的杂交事件发生在11万年前（95% CI: 0.03–0.20 Mya），其中来自东北群祖先谱系的基因贡献率（r
a=0.709）高于中国地方群。研究指出，中国地方群分化时间的估计存在较大不确定性（因该区域样本量有限，有效种群大小的95%置信区间跨度大），仍需更大样本验证，但这一结果仍表明O. venatus在日本至少已持续存在20万年以上。
**讨论与结论**
研究证实，O. venatus在日本列岛内部的遗传分化历史远比以往报道的其他草地昆虫（如Aporia hippia和Melitaea ambigua）更为古老。结合冰川期津轻海峡海平面下降（较间冰期低100–130 m）等古地理证据，研究人员推测北海道与东北群的分化可能发生在约24.3万年前冰期向间冰期过渡阶段；而间冰期向冰期过渡时植被变化使得高海拔/高纬度草地退缩，导致中部与中国地方种群发生接触与杂交。尽管DIYABC-RF模型存在一定误差，且不能排除发生多次杂交事件的可能，但研究结果明确支持O. venatus在人类迁入日本之前很久便已分布于日本列岛。
该研究首次基于全基因组SNP数据揭示了日本草地弄蝶的古老演化历史，挑战了“温暖湿润间冰期期间草地必然消失”的传统观点，表明自然干扰可能足以在无人为活动时维持草地蝴蝶的长期存续。从保护角度而言，O. venatus的遗传结构显示日本存在四个独立地理群（北海道、东北、中部、中国地方），若未来该物种需采取保护措施，应将这四个群视为独立管理单元，避免跨区域移栽导致的遗传扰动。尤其在中国地方，该物种已列入多数府县红色名录，保护优先级应高于其他地区。本研究同时发现俄罗斯远东大陆分布有O. sylvanus和O. similis，这与现有文献记录不同，表明venatus物种复合体在东欧亚大陆的分类与分布仍亟待重新厘定。
综上所述，本研究通过多尺度遗传分析证实O. venatus具有远超人类历史的古老定居史，为日本草地生态系统的自然属性提供了关键证据，也凸显了该物种及其栖息地的独特保护价值。
