《Insect Molecular Biology》：Integrative transcriptomic and machine learning approaches reveal candidate genes for silk and venom production in Bibionomorpha (Diptera)
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昆虫在其分泌系统中表现出适应性多样性，这些系统介导从防御到粘附的生态相互作用。在双翅目（Diptera）中，丝和毒液的同时出现代表了一种罕见的功能组合。本研究整合了多物种转录组学、共表达网络分析和可解释深度学习，以探究这些性状的生理和进化架构。研究人员利用来自
昆虫在其分泌系统中表现出适应性多样性，这些系统介导从防御到粘附的生态相互作用。在双翅目（Diptera）中，丝和毒液的同时出现代表了一种罕见的功能组合。本研究整合了多物种转录组学、共表达网络分析和可解释深度学习，以探究这些性状的生理和进化架构。研究人员利用来自11个Bibionomorpha科物种的从头组装（de novo assemblies），鉴定了数千个直系同源群（orthogroups），并通过加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Coexpression Network Analysis, WGCNA）和分类神经分类器（categorical neural classifiers）对其跨物种表达进行了建模。这些模型实现了对毒液和丝表型的近乎完美的区分（AUC >0.95），从而能够在直系同源群水平进行功能推断。毒液相关基因在蛋白水解和抑制结构域（胰蛋白酶样、WAP、Kunitz、丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin）中富集，而丝相关基因则表现出典型的粘附性基质的几丁质结合CBM14/围食膜蛋白（peritrophin）基序，支持其生理特化。AlphaFold3结构预测确认了这些结构域水平特征，并揭示了保守的二硫键稳定折叠，支持细胞外分泌。丝和毒液相关模块之间的最小重叠表明这些分泌系统具有独立的进化起源，体现了适应性分子趋同（adaptive molecular convergence）。研究人员的发现为双翅目分泌系统的适应性进化提供了分子、结构和生理学见解，为理解昆虫生理创新的进化提供了新视角。
**研究背景、存在问题及研究目的**
昆虫在生态适应中展现出多样化的分泌系统，丝和毒液分别在捕食、防御和粘附中发挥关键作用。然而，在双翅目（Diptera）中，丝和毒液同时出现的现象极为罕见，如*Orfelia fultoni*和*Arachnocampa luminosa*等Bibionomorpha科物种，它们还能产生生物发光，成为研究稀有性状趋同进化的独特模型。尽管这些性状在生态上具有重要意义，但分子基础仍不明确——与蛛形纲和鳞翅目广泛研究的丝和毒液系统相比，双翅目相关机制知之甚少。现有研究多集中于单一物种或单一性状，缺乏整合多物种转录组学、共表达网络和机器学习来系统探究这些性状进化的工作。因此，研究人员提出假设：毒液相关直系同源群（orthogroups, OGs）会聚类为共表达模块并显示毒素样结构域，而丝相关OGs则展现几丁质结合特征和更分散的模块性。验证这一假设有助于厘清丝和毒液在Bibionomorpha中是同源创新还是独立进化事件。该项研究发表在《Insect Molecular Biology》上。
**主要关键技术方法**
研究人员利用公共数据库（NCBI SRA，见表1）中11个Bibionomorpha科物种的RNA-seq数据，依次执行以下步骤：①使用Trinity进行从头组装（de novo assembly），并通过TransDecoder预测编码序列；②通过RSEM估计转录本丰度，利用OrthoFinder推断直系同源群；③开展跨物种加权基因共表达网络分析（WGCNA, signed network, bicor相关性）；④构建可解释的深度学习分类器（PyTorch神经网络，含MultiHeadAttention层），结合SHAP（SHapley Additive exPlanations）进行特征归因；⑤对候选蛋白进行AlphaFold3结构预测及FoldSeek结构相似性搜索。所有分析脚本和数据集已公开（Zenodo, GitHub）。
**研究结果**
1. **转录组组装和预测的直系同源群**：11个物种的蛋白质组大小差异显著（从*Odontosciara nigra*的29,008到*Orfelia fultoni*的277,904），蛋白长度分布相似，N50值反映组装连续性差异。OrthoFinder鉴定出保守和谱系特异性的OGs，未分配基因中检测到部分与蛋白水解、分泌和几丁质结合相关的结构域，提示快速进化或谱系特异性基因可能补充辅助成分。
2. **比较转录组共表达网络**：WGCNA（保留5362个OGs）获得两个生物模块——turquoise（n=389 OGs）和blue（n=325 OGs），其余为灰色模块（n=4648）。模块-性状关联整体较弱（所有FDR ≥0.35），可能因样本量小（n=11）或丝/毒液在Bibionomorpha中多次独立进化导致不同基因网络。蓝色模块为密集子网络，其枢纽基因可能维持跨物种转录组稳定性。
3. **深度学习分类器性能与生物学注释的直系同源群信号**：神经网络分类器对毒液和丝类别的区分近乎完美（AUC >0.95），对“Both”和“Neither”类别F1≈0.93-0.94。SHAP分析显示，表达量是主要驱动因素，毒液相关预测受蛋白水解酶、抑制剂和孔形成蛋白影响，丝相关预测受几丁质结合和细胞外基质注释驱动。经注释校正后，毒液相关OGs包括C型凝集素（OG0009157）、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（OG0090588）、溶血素（OG0009280）、WAP结构域抑制剂（OG0011446）和Kunitz型抑制剂（OG0048611）等；丝相关OGs富集几丁质/围食膜蛋白样特征（如OG0009177、OG0037198）和丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin, OG0002527、OG0000854）。两类OGs重叠极小，支持独立分子基础。
4. **整合深度学习、共表达模块和概率聚合的共识分析**：毒液相关OGs在turquoise模块中富集，与深度学习优先列表高度重叠，表明这些基因既被机器学习识别，又嵌入共表达结构。丝相关OGs主要分布在灰色模块，呈现更分散的遗传架构，但高置信度丝OGs在深度学习和概率提升分析中反复出现。毒液和丝共识OGs的最小重叠支持独立进化路径。
5. **蛋白质结构**：AlphaFold3模型整体置信度较高（平均pLDDT≥~80），低置信区域集中于末端和环区。丝粘附候选蛋白（OG9177、OG37198）呈现CBM14/围食膜蛋白β-三明治结构；毒液效应器包括胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（OG90588、OG48611）、金属蛋白酶（M13家族，OG38386）和孔形成蛋白（气单胞菌溶素/MACPF/溶血素样，OG9280）；毒液辅助抑制剂包括WAP/Kunitz结构域（OG11466）和serpin样蛋白（OG2527）。结构搜索显示低序列相似性（≈16-26%）但强e值，反映毒素和分泌工具基因的快速进化。
**讨论与结论**
讨论部分指出，毒液和丝类别的强区分性表明两大分泌系统在分子层面具有显著差异，支持其独立起源。毒液相关OGs涵盖多种功能类别（蛋白酶、抑制剂、凝集素、孔形成蛋白），呈现分布式遗传架构，与蜘蛛和膜翅目以保守毒素家族为主的特征不同，提示Bibinomorpha的毒液进化更依赖于不同分泌蛋白的重复招募。丝相关OGs以几丁质结合模块为主导，表明丝样功能可能通过招募通用细胞外基质成分实现，而非谱系特异性丝蛋白的扩张。共识分析中，毒液相关OGs在turquoise模块中富集，丝相关OGs则分散于灰色模块，进一步支持两种性状由不同遗传通路调控。结构预测揭示了保守的蛋白折叠模式（如丝氨酸蛋白酶催化核心、CBM14 β-三明治、Kunitz二硫键核心），说明功能约束维持了折叠水平的结构保守性，即使序列快速分化。研究结论强调：该研究建立了整合转录组学和机器学习的统一计算框架，揭示了分泌适应的遗传和生理基础，鉴定了保守的细胞外折叠、蛋白酶抑制剂和几丁质结合支架，表明昆虫进化中分泌模块的重复招募。这些发现不仅扩展了对双翅目分泌系统进化创新的理解，还为生物技术应用（如生物粘合材料、选择性蛋白酶抑制剂）提供了候选分子。未来需结合组织特异性表达分析和功能实验（如qPCR、RNAi）验证候选基因的角色。
