转基因A53T小鼠在黑质纹状体区域星形胶质细胞中具有α-突触核蛋白聚集体

《Neuropathology and Applied Neurobiology》：Transgenic A53T Mice Have Astrocytic α-Synuclein Aggregates in Dopamine and Striatal Regions

　　

目的：帕金森病（Parkinson's disease, PD）中星形胶质细胞内α-突触核蛋白的积累被认为继发于神经元积累。本研究旨在确定在黑质纹状体通路中，星形胶质细胞是否在神经元之前或之后积累小的α-突触核蛋白聚集体。方法：研究人员对来自M83 A53T帕金森病转基因小鼠模型和野生型对照的固定连续中脑和纹状体切片进行组织学处理，对α-突触核蛋白和星形胶质细胞标志物进行多重标记，并使用QuPath软件对数字图像进行星形胶质细胞定量分析。结果：黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNC）中星形胶质细胞的密度比其他采样区域高出约30%（p < 0.005）。在星形胶质细胞突起中观察到小的α-突触核蛋白聚集体，包括在野生型小鼠中，有四分之一星形胶质细胞具有明显的α-突触核蛋白聚集体。与野生型相比，A53T转基因星形胶质细胞的胞体显著增大（p < 0.001），突起数量更多（p < 0.001），符合反应性表型。A53T转基因小鼠的星形胶质细胞数量是野生型小鼠的两倍以上（p < 0.001），且含有α-突触核蛋白聚集体的星形胶质细胞数量是野生型小鼠的2.5倍（p < 0.001）。结论：这些数据表明，小的α-突触核蛋白聚集体通常由星形胶质细胞清除，而黑质致密部比中脑其他多巴胺能区域或纹状体需要更多的星形胶质细胞支持来完成这一功能。这为已知的黑质易感性因素增加了另一个脆弱性因素，即在A53T转基因小鼠模型中，星形胶质细胞清除小α-突触核蛋白聚集体的早期缺陷与星形胶质细胞反应性增加相关。

**论文解读：A53T转基因小鼠中星形胶质细胞α-突触核蛋白聚集体的研究**

**研究背景与问题**
帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种神经退行性疾病，以黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNC）多巴胺能神经元丢失和α-突触核蛋白（α-synuclein）在神经元胞质内形成路易氏病理（Lewy pathology）为特征。尽管PD目前被重新定义为神经元α-突触核蛋白病，但患者脑中星形胶质细胞也大量沉积α-突触核蛋白（40%–50%的星形胶质细胞含有聚集体，而神经元仅5%–25%），且这种沉积被认为继发于神经元积累。然而，在散发性PD中，富含α-突触核蛋白的星形胶质细胞通常不呈现反应性表型，反而具有神经保护特性（如表达维生素D激活酶CYP27B1）。相反，在A53T突变α-突触核蛋白转基因小鼠模型中，星形胶质细胞中α-突触核蛋白的积累会引发反应性并可能具有神经毒性。目前，最常用的M83 A53T转基因小鼠模型（表达人A53T突变α-突触核蛋白约5倍于内源水平）虽能模拟PD的神经元病理，但对其星形胶质细胞病理的研究尚不充分。此前对该模型在8月龄时血脑屏障的研究发现，激活的星形胶质细胞中累积寡聚α-突触核蛋白，并伴随紧密连接蛋白表达下降和血管通透性增加。然而，在症状出现前（6月龄）星形胶质细胞中α-突触核蛋白的积累情况、星形胶质细胞形态与数量的变化，以及不同脑区（SNC、腹侧被盖区VTA、纹状体CP）的差异仍不清楚。因此，本研究旨在明确：在A53T转基因小鼠模型中，星形胶质细胞是否在神经元出现显著α-突触核蛋白积累之前就已经积累α-突触核蛋白聚集体，以及这种积累是否伴随星形胶质细胞反应性改变。

**研究内容与结论**
研究人员利用6月龄M83 A53T转基因小鼠（n=5）和年龄匹配的野生型对照（n=4）的固定中脑和纹状体切片，通过多重免疫荧光标记和QuPath软件定量分析，系统评估了星形胶质细胞密度、形态、α-突触核蛋白聚集体共定位，并检测了功能标志物（VEGFA、CYP27B1）。研究发现：星形胶质细胞标志物（GFAP、S100β、ALDH1L1）在野生型和转基因小鼠中均标记相同的星形胶质细胞，未发现不同亚型。A53T转基因小鼠的星形胶质细胞胞体面积显著增大（约2倍，p<0.001），突起数量增加约35%（p<0.001），且所有脑区均呈现反应性表型。重要的是，野生型小鼠中约26%的星形胶质细胞突起中已存在小的α-突触核蛋白聚集体，暗示星形胶质细胞在正常状态下清除α-突触核蛋白。A53T转基因小鼠的星形胶质细胞数量是野生型的2倍以上（p<0.001），且含有α-突触核蛋白聚集体的星形胶质细胞比例高达64%，是野生型的2.5倍（p<0.001）。此外，SNC的星形胶质细胞密度显著高于VTA和纹状体（约30%，p<0.005），提示SNC需要更强的星形胶质细胞支持。功能上，反应性星形胶质细胞表达VEGFA（与血脑屏障功能障碍相关），但不广泛表达CYP27B1（仅偶见囊泡状共定位），这与散发性PD中星形胶质细胞的全细胞质CYP27B1表达模式不同。该论文发表在《Neuropathology and Applied Neurobiology》。

**关键技术方法**（不超过250字）
本研究采用的主要技术方法包括：① 多重免疫荧光染色：使用GFAP（胶质纤维酸性蛋白）、S100β（S100钙结合蛋白B）、ALDH1L1（10-甲酰四氢叶酸脱氢酶）三种星形胶质细胞标志物进行共标记，以最大化识别星形胶质细胞；同时使用α-突触核蛋白抗体（BD Biosciences，稀释1:1000）检测聚集体。② 图像采集与定量分析：在Leica THUNDER 3D成像系统下，以40×/NA1.1和63×/NA1.4放大倍数拍摄Z轴堆叠图像（1μm间隔，10μm深度），使用QuPath软件对星形胶质细胞数量、胞体面积、突起数量及α-突触核蛋白共定位进行手动计数。③ 样本区域：中脑采集三个层面（间隔90μm），每个层面在SNC和VTA各取一个200×200μm区域；纹状体采集三个层面（间隔600μm），每个层面取四个区域。④ 统计分析：采用多变量一般线性模型（IBM SPSS Statistics 29.0）分析基因型、区域和层面因素的影响，Tukey事后检验。样本来源：6月龄M83 A53T转基因小鼠（Jax Stock No: 004479）及野生型对照由墨尔本大学Florey神经科学与心理健康研究所提供。

**研究结果**

**3.1 中脑和纹状体观察到的星形胶质细胞类型**
通过GFAP、S100β和ALDH1L1三种泛星形胶质细胞标志物进行共标记，发现这些蛋白在野生型和A53T转基因小鼠的纹状体和两个中脑区域（SNC和VTA）中共同定位于同一星形胶质细胞，未观察到不同标志物标记出不同亚型。因此，后续实验使用GFAP或三种标志物组合以最大化星形胶质细胞识别。

**3.2 A53T转基因小鼠中大多数星形胶质细胞呈现反应性**
与野生型相比，A53T转基因小鼠所有脑区星形胶质细胞胞体面积显著增大（平均0.458±0.035 μm² vs 0.216±0.039 μm²，p<0.001），突起数量显著增加（平均4.19±0.14 vs 3.10±0.16，p<0.001），符合反应性星形胶质细胞表型。功能标志物检测显示，这些反应性星形胶质细胞表达VEGFA（与血脑屏障功能障碍相关），但仅偶见CYP27B1与α-突触核蛋白的囊泡状共定位，而非散发性PD中广泛的全细胞质表达模式。

**3.3 A53T转基因小鼠中大多数星形胶质细胞积累α-突触核蛋白**
在野生型小鼠中，约26%的星形胶质细胞在突起中具有小的α-突触核蛋白聚集体，提示星形胶质细胞正常清除α-突触核蛋白。A53T转基因小鼠中，约64%的星形胶质细胞含有α-突触核蛋白聚集体，是野生型的2.5倍（p<0.001）；且星形胶质细胞总数是野生型的2倍以上（p<0.001）。区域分析显示，SNC的星形胶质细胞密度比VTA和纹状体高约30%（p<0.005），且SNC含有α-突触核蛋白聚集体的星形胶质细胞比例略高于VTA（p<0.02）。这些变化在脑区不同层面间无显著差异。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次在野生型小鼠中观察到星形胶质细胞正常积累α-突触核蛋白（约26%的星形胶质细胞突起中含小聚集体），而神经元中未见积累，证明星形胶质细胞在正常生理条件下负责清除α-突触核蛋白。SNC中星形胶质细胞密度更高（约30%），提示该区域对星形胶质细胞功能依赖更强，这也解释了SNC在PD中的脆弱性。在A53T转基因小鼠中，症状前（6月龄）已出现星形胶质细胞反应性增强（数量翻倍、胞体增大、突起增多）和α-突触核蛋白大量积累（64%的星形胶质细胞），而神经元中仅有弥漫性积累（无明确路易病理），表明星形胶质细胞α-突触核蛋白积累先于神经元显著病理。这些反应性星形胶质细胞表达VEGFA，与血脑屏障破坏相关，但缺乏散发性PD中星形胶质细胞的神经保护性CYP27B1表达，提示该模型可能处于早期阶段，尚未启动全细胞质神经保护机制。研究人员总结认为，星形胶质细胞清除α-突触核蛋白的能力下降可能是PD黑质变性的启动事件，而A53T转基因小鼠中星形胶质细胞反应性上调是对突变α-突触核蛋白的适应性代偿，但最终可能因过度负担而失代偿。结论部分（翻译自摘要）：这些数据表明，小的α-突触核蛋白聚集体通常由星形胶质细胞清除，而黑质致密部比中脑其他多巴胺能区域或纹状体需要更多的星形胶质细胞支持来完成这一功能。这为已知的黑质易感性因素增加了另一个脆弱性因素，即在A53T转基因小鼠模型中，星形胶质细胞清除小α-突触核蛋白聚集体的早期缺陷与星形胶质细胞反应性增加相关。