一种用于人发中皮质醇测定的经济高效且可靠的高效液相色谱 - 荧光检测方法的开发与验证

《Talanta》：Development and validation of a cost-effective and reliable HPLC-FLD method for cortisol determination in human hair

　　

摘要

毛发分析越来越多地用于评估对内源性和外源性物质的长期暴露，特别是类固醇激素。本研究提出了一种简单、稳健且成本效益高的高效液相色谱 - 荧光检测法（HPLC-FLD），用于测定人发中的皮质醇。皮质醇用甲醇提取，并在 70 °C 下使用硫酸 / 乙醇（70:30, v/v）试剂进行衍生化。随后用 1 M 碳酸氢铵中和样品提取物以消除残留酸度，并通过固相萃取（SPE）小柱纯化。比较评估了两种不同的 SPE 小柱，包括 Oasis HLB 和 Bond Elut C18，以确定皮质醇回收率和基质净化效率。系统优化了衍生化参数和色谱条件，以最大限度地提高分析性能。该方法根据 ICH M10 生物分析指南在 5-200 pg/mg 的浓度范围内进行了验证。基质匹配校准表现出优异的线性（R² > 0.999），检出限和定量限分别为 1.1 和 3.5 pg/mg。平均回收率在 89% 到 108% 之间，而日内和日间精密度分别保持在 6% 和 9% 以下。基质效应最小（15.1%），使用四种互补指标进行的绿色度评估证实了该方法的环境友好特性。总体而言，所提出的 HPLC-FLD 方法为常规毛发皮质醇分析提供了 LC-MS/MS 的实用且可及的替代方案，结合了简化的样品制备、足够的灵敏度、减少的溶剂消耗和较低的运营成本。

引言

皮质醇是一种主要的糖皮质激素，由肾上腺皮质束状带在心理或生理应激原刺激下，通过下丘脑 - 垂体 - 肾上腺（HPA）轴的刺激产生 [1]。通常被称为主要的应激激素，它在维持生理稳态和协调身体对压力的反应中发挥着基础作用。皮质醇对许多生物系统产生广泛影响，包括碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢、心血管调节、免疫和炎症反应、血管反应性以及中枢神经系统功能 [2]，[3]。虽然皮质醇水平的短暂升高是帮助身体应对急性挑战的正常生理反应，但由长期压力导致的持续皮质醇过度产生已被认为与广泛的不良身心 健康结果有关 [4]。

在血浆、唾液和尿液等生物基质中检测到的皮质醇浓度变异性很大，这是由于皮质醇分泌具有显著的昼夜节律，水平通常在清晨达到峰值以促进清醒和警觉，随后在一天中逐渐下降 [5]，[6]。值得注意的是，这些传统基质中的皮质醇浓度可能会受到各种短期生理和生活方式因素的影响，包括食物摄入、酒精消耗和急性应激原。相比之下，毛发等角质化基质中的皮质醇水平提供了从数周到数月不等的时间段内累积皮质醇分泌的回顾性记录 [7]。因此，毛发皮质醇分析已成为评估 HPA 轴长期活动和监测慢性压力的宝贵工具 [8]，[9]。许多研究已将毛发皮质醇作为生物标志物应用于不同的生理和病理状况，证明在暴露于长期压力的个体中水平升高，包括经历慢性疼痛 [10]、怀孕 [11]、高强度体育训练 [12] 和酒精依赖 [13] 的人。

各种分析技术已被用于毛发样品中的皮质醇测定。早期研究主要依赖传统的基于免疫分析法的方法，包括酶免疫测定和放射免疫测定，因其简单、快速且合理的分析灵敏度 [14]，[15]，[16]。然而，由于与结构相关的内源性类固醇发生交叉反应，这些方法往往选择性有限，可能导致皮质醇浓度估计不准确。气相色谱 - 质谱联用法（GC-MS）已成功应用于皮质醇分析，并提供高分析特异性 [17]，[18]。然而，类固醇的理化特性——特别是其低挥发性和热不稳定性——可能会使 GC-MS 分析复杂化，通常需要额外的样品制备步骤和更复杂的分析工作流程，从而降低了其在常规高通量应用中的适用性。高效液相色谱 - 紫外检测法（HPLC-UV）已作为一种替代方法被研究，因其相对较低的成本和广泛的可用性 [19]。然而，皮质醇较弱的紫外吸收和共提取基质成分的潜在干扰往往限制了其灵敏度和选择性，特别是在毛发样品中通常遇到的低类固醇浓度下。最近，液相色谱 - 串联质谱联用法（LC-MS/MS）已成为毛发皮质醇测定的首选技术，因为其在复杂生物基质中具有显著的灵敏度、选择性和稳健的定量能力 [5]，[8]，[9]，[20]。尽管具有这些优势，LC-MS/MS 仪器购置和维护成本仍然很高，需要受过高度训练的人员，且在许多常规临床、法医和研究实验室中不易获得。在此背景下，高效液相色谱 - 荧光检测联用法（HPLC-FLD）代表了一种有吸引力的替代方案，结合了相对较低的运营成本、广泛的仪器可用性，以及通过简单的荧光增强衍生化步骤实现的增强分析灵敏度 [21]，[22]。除了皮质醇分析外，HPLC-FLD 和相关色谱方法已被应用于各种生物基质中内源性和外源性化合物的生物监测，具有令人满意分析性能 [23]，以及涉及类固醇相关化合物的动力学研究 [24]，[25]。

因此，本研究旨在开发并验证一种可靠、敏感且成本效益高的高效液相色谱 - 荧光检测法（HPLC-FLD），用于人发中皮质醇的测定。所提出方法的主要创新点在于建立了一个专门针对这种复杂角质化基质优化的集成衍生化 - 中和 -SPE 净化工作流程。系统优化了硫酸 / 乙醇衍生化条件和色谱条件，以最大限度地提高荧光响应，同时在 SPE 净化前引入了衍生化后中和步骤，以最大限度地减少残留酸度并提高信号强度、校准线性和测量重复性。此外，比较评估了 Oasis HLB 和 Bond Elut C18 小柱，以确定在提取回收率和基质净化效率方面最有效的净化策略。进一步采用 LC-HRMS 表征来研究在优化反应条件下形成的荧光衍生物。随后根据 ICH M10 生物分析指南对该方法进行了验证，并应用于真实人发样品，突显了其作为人发常规皮质醇监测可靠且成本效益高的分析工具的潜力。

部分片段

试剂与材料

色谱纯甲醇（MeOH）、异丙醇和乙醇由 Duksan Pure Chemicals（韩国安山）提供。皮质醇分析标准品（≥98%）、碳酸氢铵（NH₄HCO₃）和醋酸铵（NH₄CH₃COO）购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。硫酸（H₂SO₄, 98%）和醋酸（CH₃COOH）由 Samchun Pure Chemical Co., LTD（韩国安养）提供。超纯水（18.2 MΩ·cm 电阻率）来自 Corning Mega-Pure 系统（美国纽约州康宁）和

最佳荧光波长的选择

为了最大限度地提高皮质醇分析的灵敏度和选择性，系统调查并优化了影响 HPLC-FLD 分离和衍生化过程的关键参数。首先，仔细研究了荧光检测波长，因为皮质醇衍生物的分析响应高度依赖于适当激发和发射波长的选择。使用工作皮质醇标准溶液进行了三次重复优化实验

结论

总之，成功开发并验证了一种简单、可靠且成本效益高的高效液相色谱 - 荧光检测法（HPLC-FLD），用于人发中皮质醇的测定。该方法结合了有效的甲醇提取、使用硫酸 / 乙醇混合系统优化的衍生化，以及稳健的 Oasis HLB SPE 净化程序。至关重要的是，引入 SPE 前中和步骤显著提高了信号强度、线性和重复性，突显了其在

CRediT 作者贡献声明

玛丽亚姆·阿德里普尔：可视化，项目管理，调查，数据整理。黄孝珍：可视化，方法论，调查，数据整理。金正权：写作 - 回顾与编辑，验证，监督，项目管理，概念化。朴圭赫：监督，资源，项目管理，方法论。穆罕默德·A·加卜 - 阿拉：写作 - 回顾与编辑，写作 - 初稿，可视化，验证，方法论，调查，数据整理，

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

竞争利益声明

作者声明他们没有任何利益冲突。

竞争利益声明

? 作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为影响了本论文中报告的工作。

致谢

本研究得到了 忠南国立大学 的支持，由 科学和信息通信技术部 通过 韩国国家研究基金会 资助的基础科学研究计划（RS-2025-24523650，和 2016R1D1A1B02008854），以及通过 韩国基础科学研究所（国家研究设施和设备中心）资助的基础科学研究能力提升项目，由 教育部 提供资金（资助编号 2019R1A6C1010030）。

穆罕默德·A·加卜 - 阿拉 | 黄孝珍 | 玛丽亚姆·阿德里普尔 | 朴圭赫 | 金正权

忠南国立大学化学系，韩国大田