碱提pH对木苹果（Aegle marmelos）籽蛋白分离物结构、功能及营养特性的影响

《Applied Food Research》：Effect of extraction pH on structural, functional, and nutritional characterization of bael ( Aegle marmelos) seed protein isolate

　　

木苹果（Aegle marmelos）籽为木苹果果品加工副产物，富含蛋白质，在功能性食品与营养保健品中具有较大潜力。研究人员评估了pH 9、10、11、12碱性提取对木苹果籽蛋白分离物（BSPI）结构、功能、热学及抗氧化特性的影响。提取pH 11被确定为最优条件，所得蛋白分离物功能特性增强：溶解度（39.57±0.17%，w/v）更高，乳化稳定性（163±2.5%）改善，热稳定性更高（83.5 °C），ζ电位为负（-44.56±1.5），粒径更小（1332±5.6 nm）。pH 11下BSPI的体外蛋白消化率（67±0.05%）与抗氧化活性（DPPH和ABTS法测定）均显著升高（P<0.05），表现出更优的生物特性。pH 11下功能特性的提升与结构变化密切相关，包括蛋白质展开程度更大、表面电荷更高、表面疏水性更高（27.59±0.13）。氨基酸谱分析显示BSPI具有高生物价，所有必需氨基酸水平较高，必需氨基酸指数更高，表明其作为高质量替代植物蛋白源潜力优良。综上，pH 11碱提所得木苹果籽蛋白分离物在结构、功能、热学、抗氧化及营养特性上均较优。研究结果同时证明木苹果籽加工废弃物可成功高值化利用，经进一步研究可用于人类营养，助力可持续发展。

研究背景与立项依据：全球蛋白需求随人口增长持续上升，植物蛋白因生态足迹低、契合素食与伦理偏好而受关注。木苹果（Aegle marmelos）为芸香科本土药用植物，果实加工后籽、皮、渣多被丢弃，而木苹果籽含油35–37%、蛋白约35–37%，脱脂后粕中蛋白可达60–70%，是未被充分利用的替代蛋白资源。传统碱提-等电沉淀法成本低廉，但提取pH过高会降解敏感氨基酸、损害蛋白品质，而pH过低则回收不足。已有研究提示提取pH显著影响花生粕、荞麦、苋籽等植物蛋白的理化功能，但木苹果籽蛋白在不同碱提pH下的结构-功能-营养关联尚无系统报道。为此，研究人员在《Applied Food Research》发表该研究，旨在从pH 9、10、11、12中优化木苹果籽蛋白分离物（BSPI）提取条件，阐明pH如何通过结构重排调控功能、热稳、消化、抗氧化与氨基酸营养，为加工废料高值化与可持续蛋白开发提供机制依据。

主要技术方法概览：研究采用单一批次印度Lucknow产木苹果籽，40 °C烘干脱壳过500 μm筛，索氏法正己烷脱脂得脱脂粉（DF，蛋白70.32%）。蛋白提取沿用碱提-酸沉法（Gao等，2020微改）：DF按1:20加水，0.5 M NaOH调pH至9/10/11/12，室温磁搅60 min，4 °C 2297×g离心取上清，0.5 M HCl调至pH 5.5沉淀，4700×g离心收集，水洗中和至pH 7后-80 °C冻干得BSPI。围绕样品，研究人员依次开展近缘组成分析（AOAC法+凯氏定氮）、功能特性（溶解度Lowry法、水/油保持容量WHC/OHC、乳化活性/稳定性EAI/ESI）、结构解析（傅里叶变换红外FTIR、差示扫描量热DSC、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE、场发射扫描电镜FE-SEM、粒径与ζ电位、表面疏水性H₀以ANS荧光初斜率计、UV-Vis吸收与内源荧光）、体外胃肠消化模拟（Minekus法改）测IVPD、DPPH/ABTS抗氧化、HPLC氨基酸谱及cPER/EAAI/生物价BV/营养指数NI计算。

研究结果

3.1 近似组成：BSPI蛋白含量随pH从84.37%（pH 9）升至89.38%（pH 12），灰分、碳水、纤维同步下降，脂肪残留1.01–1.64%几乎不受pH影响。pH 11与12蛋白纯度无统计差异，但pH 12溶解度崩塌，故高纯度不等于高功能。

3.2 蛋白得率与回收：得率从17.51%（pH 9）升至23.89%（pH 12），回收率从24.37%升至35.26%；pH 11（23.84%/35.21%）与pH 12无显著差异，说明超过pH 10后碱度提升边际效益递减。

3.2.1 溶解度：pH 11最高（39.57%），pH 12骤降至11.15%，归因于过度碱致部分变性聚集与疏水基团暴露。

3.2.2 WHC与OHC：WHC在pH 12最高（结构展开露极性残基），pH 11（1.70 g/g）与pH 9/10无差；OHC从2.08（pH 9）升至4.73 g/g（pH 12），pH 11为4.56 g/g，碱展开促疏水残基结合油相。

3.2.3 乳化：EAI在pH 12最高（95.8 m²/g），ESI在pH 11最高（163 min），高pH电荷分布与界面铺展增强，但pH 12因聚集反损稳定性。

3.3 FTIR：酰胺I/II/III带随pH偏移，pH 11酰胺III移至1237.23–1392.5 cm^-1，提示α螺旋/β折叠重排与氢键网络改变，pH 12出现2186.3 cm^-1异常峰，印证过度碱处理构象损伤。

3.4 热特性（DSC）：变性峰温T_d在pH 11达83.5 °C（起始54.6 °C，中点68.4 °C，终点82.1 °C），焓变ΔH 29.64 J/g为各组最高；pH 12 T_d跌至78.9 °C、ΔH 16.46 J/g，表明pH 11结构最有序、需能最高，pH 12发生不可逆聚集。

3.5 UV-Vis与折叠比：220–240 nm芳香族吸收随pH 9→11增强，折叠比1.66→1.72，pH 12回落至1.70，说明pH 11解折叠露色氨酸/酪氨酸最适，极端碱致复聚。

3.6 内源荧光：最大发射350–360 nm，pH 10荧光强度最高（色氨酸暴露峰值），pH 11仍高，印证三级结构展开而非完全变性。

3.7 SDS-PAGE：DF弥散弱带，BSPI在15–55 kDa出现4条带——~55 kDa（7S vicilin单体）、~35 kDa（11S legumin酸性α亚基）、~25 kDa（11S碱性β亚基）、17–18 kDa（2S白蛋白）；pH升高带加深，因解聚助SDS结合，但亚基数不变。

3.8 FE-SEM：pH 9颗粒粗糙团聚，pH 11表面最平滑致密，pH 12再现细微皱缩，与粒径1332 nm、ζ -44.56 mV互为印证。

3.7节后接IVPD与抗氧化：pH 11的IVPD 67±0.05%为各组最高（pH 12回落），DPPH与ABTS的TEAC值亦最高，归因为展开结构利酶切与酚类残基暴露；氨基酸分析（pH 11 BSPI vs DF）显示必需氨基酸齐全，Leu、Lys、Val等偏高，EAAI与BV优于DF，cPER双式计算均良性，NI因蛋白百分含量高而跃升。

讨论与结论翻译：研究人员讨论指出，碱提pH通过调节羧基电离与静电斥力控制溶解度，但越过pH 11后蛋白质展开转为聚集，致pH 12功能（溶解、ESI、T_d、IVPD）全面回撤，印证“适度展开最优”假说。结构手段（FTIR/DSC/荧光/粒径）一致指向pH 11时BSPI处于高电荷、高展开、高表面疏水但未交联的状态，从而协同提升乳化稳定、热稳与消化抗氧化。营养上BSPI必需氨基酸谱接近优质植物蛋白，EAAI/BV支持其作辅食蛋白补充。结论部分原文要义为：碱性提取pH 11产出兼具高结构有序性、优功能界面性、高热稳（83.5 °C）、高体外消化率（67%）与高抗氧化（DPPH/ABTS）及高生物价（EAAI提升）的木苹果籽蛋白分离物；该研究首次建立木苹果籽蛋白“提取pH—结构解折叠—功能营养”机制链，证实果加工废籽可转化为可持续替代蛋白原料，呼应减少食物浪费与 malnutrition治理的SDGs目标。