综述：单基因疾病的分子产前诊断，迈向无创技术

《Archives of Medical Research》：Molecular Prenatal Diagnosis of Monogenic Diseases, Towards Non-invasive Procedures

　　

在本综述中，我们概述了单基因疾病产前诊断的历史进程及现代进展。最初依赖侵入性采样程序，产前诊断通过整合高通量分子技术（如下一代测序）得到了发展。这些技术现在允许全面检测基因组范围内的致病变异。一项重大突破发生在发现来源于胎盘的游离胎儿 DNA（cfDNA）存在于母体血浆中。这一发现促成了无创产前检测（NIPT）的发展，目前已广泛应用。然而，单基因疾病的无创产前诊断（NIPD）开发时间较长，主要原因是需要高灵敏度的测序方法和复杂的统计分析来确定母体传递。目前，只有少数国家在临床环境中实施了 NIPD。多种可用的技术和方案可能会使产前咨询期间提供的信息复杂化。然而，掌握关于 NIPD 的知识和伦理问题将确保为单基因疾病传递风险妊娠提供最佳服务和更好的护理。

引言
单基因孟德尔疾病是一组罕见、异质性疾病，影响全球近 3 亿人。这些疾病是目前已知的 7000 种罕见病之一（1）。大多数没有预防或治愈性治疗，因此产前诊断在有风险传播不可治愈且特别严重的单基因疾病的家庭的医疗管理中起着重要作用。随着需要在新出生儿早期给予的或可以在宫内阶段尽早提供的创新疗法的出现，产前诊断正在承担起新的治疗维度。在本综述中，我们将讨论产前诊断的过去和当前范围，重点关注诊断单基因疾病的创新方法，特别是无创方法。

1958 年，美国妇科医生伊恩·唐纳德及其团队开发了一种二维超声设备，这是超声技术的先驱（2）（图 1）。随着产科成像技术的不断进步，某些科学观察促进了产前诊断技术的发展。安德烈和乔埃勒·布埃的工作表明，流产不是妊娠过程的意外失败，因为大多数流产胚胎携带染色体异常。乔埃勒·布埃曾在雷蒙德·图尔潘的团队中接受细胞遗传学技术训练，该团队包括研究员玛尔塔·戈蒂埃，她是发现 21 三体综合征原因的研究员（3）。1972 年，乔埃勒·布埃开发了胎儿细胞培养技术，这对于胎儿核型分析至关重要，因此也是通过羊膜穿刺进行产前诊断所必需的（4）。因此，在 20 世纪 70 年代，孟德尔疾病的产前诊断很少见，只能为少数疾病提供。当时许多可用的测试基于通过侵入性程序获得的胎儿细胞培养，这些程序通常在孕 16 周后进行，需要 2-3 周的延迟让细胞生长。

随后很快开发了其他技术，包括 1979 年的经皮脐静脉血取样（5）和 1983 年伊夫·杜梅兹进行的首次绒毛膜绒毛取样（6）。这些技术使得能够在怀孕第一孕期研究胎儿 DNA（图 1）。大约在这个时候，在米歇尔·戈森斯教授团队的指导下，分子生物学技术的出现使得产前诊断的范围扩大到包括孟德尔疾病（7）。在 20 世纪 80 年代初，利用限制性内切酶和 Southern 印迹分析与疾病基因相关的限制性片段长度多态性（RFLPs），使得连锁研究得以发展。这些研究能以合理的确定性确定致变异是否已被胎儿遗传。在 20 世纪 90 年代初，随着 PCR 和基于 PCR 的多重检测的出现，变异的检测效率和准确性得到了提高。到了 20 世纪 90 年代末和 21 世纪初，诸如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态性（SSCP）和变性高效液相色谱（dHPLC）等变异扫描技术将几种已确定相关基因的孟德尔疾病的变异检测率提高到了 90%（8）。自 2010 年代中期以来，技术的进步，如高通量测序（下一代测序，NGS），使得能够识别参与孟德尔疾病的数千个基因（图 1）。

产前诊断测试通常在来自胎儿环境的 DNA 样本上进行。尽管无创程序正变得越来越普遍，但近年来侵入性程序的数量保持稳定，正如法国国家登记处所示（图 2）。这可能是由于高通量测序方法的发展，增加了已知遗传病的检测并识别了更多的致病变异。据我们所知，没有关于侵入性程序相对于无创替代方案影响的广泛报告。由于这些无创程序在全球范围内很少实施，因此不太可能已经测量了它们的全球影响。绒毛膜绒毛取样（CVS）可以通过宫颈或腹墙进行，通常在孕 9-14 周之间，确保早期产前诊断（图 3）。该样本可实现早期产前诊断，但可能被母体组织污染或包含胎盘局限型染色体非整倍体（9）。后来，开发了涉及采样包含胎儿来源细胞的羊水的羊膜穿刺术。通常在孕 15 周后进行，可以一直持续到妊娠末期。由于这些细胞主要来源于胎儿而不是胎盘，羊水分析导致母体细胞污染率较低，且没有胎盘局限型嵌合体（10）。然而，这些程序并非没有产科风险。最显著的风险是流产，估计风险范围从 0.1-1.3% 不等，取决于采样技术、妊娠类型（例如，双胎妊娠）和操作者的经验。其他潜在并发症包括羊水渗漏、宫内感染、意外胎儿损伤和母体细胞污染。后者特别发生在绒毛膜绒毛取样期间（11）。

单基因疾病的产前诊断可以检测先前确定的与疾病家族史相关的致病变异，或与家族史、超声检查或血液检查（如游离 DNA 或血清标志物筛查测试）引起的诊断怀疑相关的致病变异（12）。因此，快速识别潜在的致病变异对于调整产前或围产期管理以及为当前和后续妊娠提供遗传咨询，以及其他家庭成员至关重要。最常见的指征是囊性纤维化、斯坦因特病、普拉德 - 威利综合征、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩症、软骨发育不全、脆性 X 综合征、软骨发育不全和杜氏肌营养不良（https://www.agence-biomedecine.fr/fr/donnees-consolidees-des-activites/diagnostic-prenatal）。染色体畸变是先天性异常和流产的重要原因，发生率约为每 150-200 例活产中有 1 例（13）。常规核型分析可检测染色体畸变，包括数目和结构畸变，分辨率为 5-10 Mb。它还能检测嵌合体并表征染色体重排。单核苷酸多态性（SNP）芯片和比较基因组杂交（aCGH）芯片是两种广泛可用的染色体微阵列平台。这些技术是高分辨率、全基因组的诊断遗传学工具，可检测 DNA 序列的变化，称为大小>10-100 kb 的拷贝数变异（CNVs）。然而，它们无法检测真正的平衡重排，也不能表征染色体结构重排（14）。尽管这是一个重大进展，特别是对于伴有胎儿结构异常的妊娠，但核型分析与染色体微阵列的结合仍然使至少 60-70% 产前检测出先天性异常的胎儿没有遗传诊断（15）。其中许多病例预计是由基因中的致病变异引起的，这与新生儿中孟德尔疾病的显著患病率一致（16）。

短读长 NGS 技术在遗传学中的广泛实施使得基因 panel、全外显子组测序（ES）和全基因组测序（GS）在产前诊断中得到了广泛使用（图 4）。选择的产前遗传诊断测试类型首先取决于对胎儿表型的准确了解。例如，如果表型提示重复扩增疾病，如 DMPK 3’非翻译区（导致强直性肌营养不良）的重复，或甲基化异常，如染色体 11p15 上 IC1 的高甲基化或 IC2 的低甲基化（导致贝克维茨 - 韦德曼综合征），测序方法并不适用。然而，经过验证的算法方法正在被引入。尽管如此，建立报告胎儿变异的同质标准仍然是一个重大挑战。在大多数国家，已知遗传变异的产前分子诊断仅适用于根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南被分类为致病性或可能致病性的变异（17）。在选定情况下，产前 ES 可能是合理的，例如在多发性异常的胎儿中或标准遗传学测试（例如，核型或微阵列）仍未确诊的复发性胎儿表型病例中。ACMG 建议当靶向遗传学测试未能解释结构异常胎儿中疑似的单基因疾病时，考虑 ES。重要的是，产前 ES 应仅在咨询临床遗传学家后要求，以确保适当的病例选择、解释和咨询（18）。在产前诊断中，三人组测序（包括父母双方和胎儿）经常使用，尽管成本高于单人策略，因为这种方法通过识别新发变异（存在于胎儿但父母中不存在）和确定隐性变异的遗传方式确保了最佳诊断率（19）。ES 的诊断率取决于几个因素，包括使用三人组与仅受检者测序、单一与多种异常的存在，以及病例是否由遗传学专家预选（20）。最近的评论表明，胎儿 ES 的诊断率范围为 6-92%，平均为 32%（15,21., 22., 23., 24.）。这种变化反映了胎儿队列的异质性（包括多发性先天性异常或孤立性畸形）、使用的 ES 策略（单人或三人组）以及 ES 前进行的测试（微阵列、panel 测序）（23）。虽然调查的异常数量和样本量的差异可能解释了部分差异，但加权平均诊断率对于骨骼发育不良为 86%，中枢神经系统异常为 44%，先天性心脏缺陷为 11%，颈项透明层增加病例为 8%（22）。最低的产出率见于泌尿生殖系统（4%）和呼吸系统异常（0%）的胎儿（24）。有趣的是，在一组 1,010 名结构正常的胎儿队列中，三人组 ES 识别出 2.7% 的潜在重要变异，其中 64% 是显性新发，表明单基因疾病（25）。应考虑为家庭在妊娠早期提供结果的周转时间，以及简化流程的方法。一项系统评价报告称，在研究和临床环境中进行的产前 ES 的中位周转时间为 20 天（26）。最近，在英国（UK）临床环境中观察到的周转时间较短，范围为无诊断 14 天到诊断 16 天（27）。最近一项法国研究对 150 个产前样本发现，最终分子报告的中位时长为 28 天，这与妊娠期间的决策相容（28）。

除了 ES，GS 分析基因组的内含子、外显子和基因间区域。GS 可以克服 ES 的一些局限性。例如，它能更有效地检测结构变异并克服某些编码区覆盖不足的问题，这可能导致编码变异无法检测。然而，GS 也有其自身的局限性，包括由于产生的数据量导致的计算负担以及解释新结构或非编码变异的困难（29）。此外，提供更全面的检测，GS 不需要 ES 使用的捕获步骤，并且需要较少的 DNA（100 ng 对比 350 ng）（30），从而产生更快的周转时间。在新生儿重症监护室环境中，快速 GS 最快可在 17 小时内完成，尽管通常是在 48 小时内完成（31,32）。然而，目前大多数快速周转时间数据来源于产后或新生儿环境，其在产前工作流程中的直接适用性仍有待确定。2022 年，国际产前诊断学会（ISPD）指出，ES 和 GS 都面临重大挑战，包括父母和/或胎儿的意外发现、对家庭成员的影响以及未来重新分析的责任。

他们补充指出，由于验证数据不足，以及对其益处和缺陷的认识有限，目前不支持将产前外显子组测序（ES）和基因组测序（GS）作为所有怀孕的常规诊断测试，特别是在胎儿没有已知先天性异常的情况下。这支持了需要进行前瞻性研究来验证此类检测（33）。GS 最近才开始用于产前诊断，主要通过研究项目（表 1）（34., 35., 36., 37., 38.）。与更标准的基因检测相比，产前 GS 的增量检出率尚未得到充分记录（39）。最近的一项研究发现，GS 比 ES 仅多出 1% 的增量检出率（31）。对胎儿样本的 GS 检测出了之前由 ES 和染色体微阵列识别出的 100% 的变异，但只检测出了 62.5% 的平衡染色体重排（40）。

在使用 ES 或 GS 时，在就意义不明确的变异（VUS）咨询患者时应格外小心。ES 和 GS 都会产生相当数量的 VUS。VUS 可能很难阐明，特别是当胎儿影像学提供的表型有限时。如果妊娠未终止或丢失，建议在产后期间对任何 VUS 进行重新分析。在医疗终止妊娠或胎儿死亡的情况下，建议进行胎儿尸检并保存组织。研究这些组织最终可能允许对 VUS 进行重新分类。国际指南一致建议不要在产前常规报告 VUS。包括国际产前诊断学会（ISPD）、美国妇产科医师学会（ACOG）、母胎医学会（SMFM）、加拿大医学遗传学家学院（CCMG）、加拿大妇产科医师协会（SOGC）和欧洲人类遗传学会（ESHG）在内的专业组织一致认为，只应披露致病或可能致病且能解释胎儿表型的变异（表 2）（34,41., 42., 43., 44.）。然而，几个国家框架（例如英国国家医疗服务体系（NHS）基因组医学服务、荷兰、加拿大和法国）允许在存在强表型一致性、有亲本分离数据可用，或变异可能影响妊娠或新生儿管理时，选择性报告 VUS（表 2）。这些案例应由多学科团队仔细审查，父母应接受关于这些变异的确定性和可能重新分类的特定咨询。

通过 ES 和 GS 识别出的偶然发现和次要发现也可能对及其家庭产生超出检测主要指征的影响。次要发现是在与检测原因无关的基因中检测到的致病或可能致病变异，但在临床上可采取行动，因为它们赋予严重、可预防或可治疗状况（如遗传性癌症或心肌病）的显著风险（表 2）。美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）提供了一份推荐报告次要发现的基因列表。患者通常在知情同意过程中被提供拒绝披露这些发现的机会。相比之下，偶然发现是在主要指征和公认的应报告基因列表范围之外发现的意外结果。与次要发现不同，偶然发现无法被系统预测或选择退出，其临床相关性在发现时可能不清楚。在产前背景下，大多数专业协会建议不要主动搜索或报告次要发现（表 2）。ISPD、ESHG 和 ACOG/SMFM 强调，产前测序应针对胎儿指征，因为次要发现通常涉及与妊娠期间相关性极小的成年发病状况，并可能导致额外的焦虑和伦理困境。因此，除非有直接影响妊娠管理的令人信服的医疗理由，否则一般不鼓励在产前环境中主动分析 ACMG 次要发现基因列表。一些国家框架，如英国和法国，明确将次要发现排除在产前报告之外，同时允许在医疗必要时进行产后随访或父母检测。总体而言，目前的国际共识倾向于将分析和报告限制在与胎儿表型相关的变异上。明确的检测前咨询应告知父母，不会系统地寻求或披露次要发现。

适当检测的选择在很大程度上依赖于胎儿影像学、家族史和产科史、疑似遗传诊断、疾病机制以及每种检测的检测能力等关键细节。因此，这种选择应由多学科团队讨论。鉴于许多问题（如遗传疾病的胎儿表现）是妊娠特有的，建议对所有病例进行彻底的检测和检测后咨询。此外，必须根据检测的周转时间考虑孕周。父母在通过侵入性程序进行产前诊断时，由于感知到的流产风险而经历显著的焦虑，尽管这种风险仍然极低（11）。尽管如此，考虑到一种具有相当特异性、敏感性和周转时间的非侵入性替代方案是可取的，这是合理的。几项研究表明，当可用时，非侵入性方法（如妊娠期间的母体采血）受到患者和医疗服务提供者的青睐（45）。

循环核酸最早于 1948 年被识别（46）。几十年后，这一发现为液体活检的概念铺平了道路，该概念基于对血浆中循环的无细胞 DNA（cfDNA）的分析。液体活检提供诊断信息，特别是在癌症中，使无法触及的组织变得可触及，这是优于传统侵入性活检的优势。随着 1997 年在携带男性胎儿的孕妇血液样本血浆中发现 Y 染色体 DNA，胎儿遗传物质的非侵入性研究成为可能（47）（图 5）。在妊娠期间，胎儿和母体基因组都以高度碎片化的 cfDNA 形式存在于孕妇血浆中。这种 cfDNA 从孕 3 周起即可检测到，被称为胎儿无细胞 DNA（cffDNA）。母体成分是 cfDNA 的主要成分，而胎儿（胎盘来源）成分是次要成分（48,49）。由于其平均半衰期短（16 分钟），cffDNA 特异性于当前妊娠。因此，它在分娩后迅速从母体血流中清除，并在产后 2 天内变得无法检测（50）。胎儿份额（ff）在孕 6 至 17 周之间每周增加约 0.1%，此后更快，每周增加约 1%（51,52）。ff 可能受母亲身体质量指数、可释放 cfDNA 的母体相关疾病、孕周、胎儿数量和胎儿非整倍体存在的影响（53）。胎儿 21 三体与 ff 增加相关，同时 13 和 18 三体与较低的 ff 相关（54）。多胎妊娠的“合计”ff 高于单胎妊娠。然而“每个胎儿”的 ff 较低。在单绒毛膜双胎妊娠中研究 cffDNA 高度相关，因为双胎胎儿几乎总是同卵的，且在发育过程中获得的少数合子后变异将它们区分开来（55）。如果在多胎妊娠期间一个胎儿死亡，解释 cffDNA 用于产前筛查或诊断也可能很困难，因为死亡胎儿的胎盘可以在超过三个月的时间内释放 cffDNA（56）。母体 cfDNA 片段的分布显示峰值大小为 166 bp，而 cffDNA 为 143 bp。测试样本中存在 cffDNA 作为良好实践，可以通过检测表观遗传标记（其甲基化状态在胎盘和母体 DNA 之间不同，例如 RASSF1A 基因（57）或通过识别母体基因组中不存在的变异（例如父源基因组变异）来确认。尽管有许多关于 cfDNA 生物学特性的研究和重大发现，但这些特性中的许多仍然很大程度上未知。例如血浆 DNA 的大小分布、胎儿来源 DNA 的比例以及不同孕周母体血浆中的甲基化水平。

近年来，胎儿非整倍体的无创产前检测（NIPT）迅速改变了全球产前筛查格局。虽然许多 NIPT 在技术上基于浅层 GS，但报告主要限于常见的 21、18 和 13 三体。由于相关的假阳性结果，主要是由胎盘局限性嵌合引起的，NIPT 仅被视为筛查测试（58）。在一般人群中，21 和 18 三体的阳性预测值分别为 96% 和 98%，但对于结构畸变和罕见常染色体三体，分别降至 32% 和 6%（59）。扩展 NIPT 提出了更广泛的问题，即在缺乏具体法规和指导的情况下如何在临床环境中保持可靠性。它也提出了关于所需适当咨询的问题，以确保知情同意并避免伤害孕妇（60）。此外，一小部分筛查测试（约 0.03%）也可能导致偶然怀疑癌症，特别是当存在多种染色体畸变时（61）。

基因测序技术的进步扩大了可以提供 NIPT 筛查的疾病范围。很少有研究举措在产前背景下针对一般人群的单基因疾病进行筛查。得益于新发变异的发现，这些举措主要关注显性遗传的疾病（62）。非侵入性、多基因产前测序在商业上可用于低风险妊娠，并涵盖广泛的单基因疾病。然而，他们建议需要侵入性检测来确认高风险结果（63）。ACOG 对这些测试在无适当医疗监督的合格医疗保健环境之外的无监督使用表示担忧。确保患者充分了解这些测试的敏感性、特异性和阳性预测值，以及与某些状况相关的不完全外显率和可变表达性至关重要。应告知患者复杂概念，例如关于 VUS 的公司政策（64）。

由于以前的 NIPT 仅是筛查测试，阳性结果必须通过侵入性采样来确认。在临床诊断环境中，出现了旨在向有已知单基因疾病高传播风险的家庭提供靶向无创产前诊断（NIPD），或在高度提示超声怀疑的情况下（如致死性骨发育不良或软骨发育不全）的举措（65）。

提议用于常规诊断实践的 NIPD 首次应用基于对母体基因组中不存在的事件的定性检测。一个例子是搜索特定 Y 染色体序列，这将表明存在男性胎儿（48）。自那以后，NIPD 的应用范围已扩大到包括有传播严重且无法治愈的单基因疾病风险的夫妇，在以下情况下：涉及显性疾病的父源致病变变、涉及隐性疾病的父源致病变异（前提是双方父母携带不同变异），以及以前妊娠中发生的新发致病变异。一些实验室开发了使用选定基因面板 NGS 的 NIPD，并将其纳入诊断常规。根据研究，这种方法具有 96.0–100% 的特异性和 87.5–96.2% 的敏感性（66,67）。这种方法的优势在于同时测试每个基因中的多个变异。然而，它仅适用于经常被指示用于产前诊断的基因。此外，NIPD 中的 NGS 方法需要高读取深度并产生额外成本，以足够的敏感性检测低频等位基因变异。最后，已报告了与此方法相关的假阳性和假阴性，并且可能与等位基因脱落现象（在测序过程中偏向一个等位基因而不是另一个）和 cfDNA 非随机片段化（尽管有足够的覆盖率和 ff，但可能导致给定基因组位置胎儿等位基因显示不足）的组合有关。近年来，数字 PCR 方法取得了显著进展，克服了 NGS 的缺点并满足了 NIPD 的敏感性和特异性要求（68）。这种依赖变异的方法需要针对所靶向的父源或新发变异定制开发引物和探针测定。设计和验证定制测试需要两到三周时间。NIPD 采样可从孕 8 周开始，结果在一周内交付。这避免了后续妊娠管理的任何延迟。据我们所知，迄今为止在大临床系列中未报告假阳性或假阴性结果（69）。可扩展性和成功的全国实施最近已得到评估（70）。然而，该技术无法检测除靶向以外的遗传变异。

它也不适用于检测母体变异或双方父母均为同一变异携带者的病例。对于单核苷酸变异或小片段插入缺失以外的变异类型，除非结构变异的断点能在核苷酸水平上确定，否则同样不适用。在多重妊娠的情况下必须谨慎处理，因为检测父源变异并不能揭示有多少个胎儿携带该变异，也不能确定是哪一个胎儿携带。对于常染色体隐性遗传病，如果识别出父源变异，则必须通过侵入性取样来评估母源变异是否存在。为了开发NIPD服务并方便患者获取，法国公立部门内的多个分子遗传学实验室已组成一个网络，从而建立了法国首个针对单基因病的NIPD网络（71）。该网络通过知识共享、方案标准化以及通过实验室间交流实施质量控制，促进和标准化了全国范围内的活动组织。然而，尽管有这些特定举措，NIPD在常规诊断中的实施仍然缓慢，且仅限于少数国家，主要在欧洲。

要在存在母源变异传递可能的单基因病背景下提供NIPD，需要能够研究同样存在于母体cfDNA中的胎儿变异。为此已开发出两种主要方法：相对突变剂量分析（RMD）和相对单倍型剂量分析（RHDO）。这两种分子计数方法的主要区别在于其本质。RMD直接且特异性地检测感兴趣的致病变异。而RHDO则需要事先构建目标区域可能的母源和父源单倍型。然后通过定性定量检测母体血浆中的这些单倍型，以推导出胎儿的遗传情况。RMD仅需采集母体血样，而RHDO需要父母双方的样本以及胎儿的额外近亲样本。迄今为止，RMD仅成功应用于少数几种单基因病（72,73）。实际上，这种针对致病变异进行直接定量研究的方法似乎困难，甚至不可能实现，主要原因是cfDNA的绝对浓度较低，导致事件数量有限。这种低浓度无法评估令人满意的统计稳健性。此外，由于重复序列、同源假基因和复杂基因组重排，该方法仅限于某些基因组位点。最后，前述的等位基因丢失现象可能会扭曲结果。因此，据报道相当大比例的病例结果不确定甚至被错误分类（73）。因此，RMD分析仍处于概念验证阶段。仅在少数研究中以少量患者进行了评估，据我们所知，从未在临床实践中应用过。RHDO方法通过连锁分析重建单倍型时，考虑了致病变异周围数千个基因组位点。因此，除了母体血浆外，还需要母体核DNA、父体核DNA以及额外近亲的DNA。该方法已在临床环境中成功应用，目前英国NHS向关注杜氏肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症和囊性纤维化的家庭提供此项服务（74,75）。然而，对统计误差的稳健控制以及用于评估分析质量的质量控制程序的明确描述尚未得到广泛记录。因此，开发了一种通用的、可适配的增强型RHDO（eRHDO）程序（76）。其诊断性能仍取决于ff、测序质量以及分析的有信息位点数量。该方法的优点是理论上可应用于所有类型的致病基因组变异。然而，在近亲婚配的情况下，该方法的有效性可能会降低。这一问题可以通过使用其他统计方法加以缓解。此外，为克服对受检者DNA的需求，已实施或正在评估特定的测序计划，如长读段高通量测序。可以使用长读段测序数据构建亲本单倍型，然后以相位方式与短读段NGS NIPD结合使用，进行不需要受检者样本的RHDO程序（77）。长读段测序技术也已应用于NIPT，用于检测携带者孕妇的染色体重排，采用不依赖近亲的单倍型推导方法（78）。

总体而言，这些方法在临床适用性、可扩展性、周转时间和验证水平方面存在差异，在选择检测策略时应予考虑。

如前所述，循环cfDNA的大小分布、片段末端的核苷酸基序以及不同孕周母体血浆中的甲基化水平在很大程度上仍未知。进一步了解cfDNA的大小分布和碎片化模式将有助于阐明其来源和碎片化机制。这将增强我们利用cfDNA作为分子诊断工具的能力。目前正在进行利用cffDNA特征的研究以改进NIPD。例如，胎儿DNA和母体DNA之间的尺寸差异已被用于提高血浆样本中的ff。2020年，Van Campen J等人证明，选择大小<155 bp的片段大约使胎儿比例翻倍，并能更准确地识别胎儿基因型（79）。相反，Shaw J等人证明，X染色体失活研究可以利用X染色体特定区域的甲基化来区分NIPD中血友病或肌营养不良病例的母体等位基因（80）。最后，Tsui A等人分析了循环片段的5′基序（4-聚物），并确定了特定的胎盘富集，从而能够概率性地归属胎儿来源（81）。基于人工智能和机器学习的分析、统计和生物信息学工具的进步，有望在未来利用这些特征来提高NIPD性能（82,83）。

另一个感兴趣的领域是从母体血浆中无创测序整个胎儿基因组。当超声检查结果提示单基因病时，以及当父母已知自己为携带者、针对特定单基因病进行遗传咨询时，这种方法将非常有用。与使用靶向基因面板、因此仅涉及产前诊断中最常涉及的基因的经典RHDO方法不同，这种全基因组方法将能够进行单基因NIPD，无论涉及哪个基因或何种遗传方式。关于GS的几篇概念验证论文已经证明了重建整个胎儿单倍型和基因型的可行性。然而，此类分析的高成本以及数据解读和遗传咨询的困难目前限制了其研究用途。需要重大的技术进步才能实现经济实惠的、无创的全基因组胎儿异常基因检测。此外，此类检测在患者群体和医疗专业人员中的临床价值仍有待充分探索。

扩展无创产前技术的社会影响也引发了对可能强化能力主义规范的潜在担忧。在生物伦理学和残疾研究领域中发展起来的被称为"表达主义异议"的主要批评认为，使用产前检测来避免残疾人士的出生可能传达了对残疾者生命的负面评价（84）。根据这一观点，此类技术的常规使用不仅仅是中立的医疗实践，它还可能有助于塑造关于哪些生命被视为可接受的社会规范。该学科采取跨学科方法探讨这些概念，准确捕捉残疾人士及其家庭对不断变化的产前基因技术格局的细致反应。受影响个体和家庭之间的反应是异质的。许多人同时支持获取生殖技术，同时对其潜在的社会后果保持关注。

结论

几种其他NIPD方法仍在开发中，将进一步增加符合条件的妊娠数量。虽然NIPD的诊断性能特别取决于充足的ff，但对任何使用的方法验证最佳性能都是必需的。需要关于在哪些条件下应用某些检测的准确信息，特别是关于意外发现的可能性，例如非婚生父关系或怀疑母体恶性肿瘤。

致谢

本综述未从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何特定拨款。

Camille Verebi|Juliette Nectoux|Thierry Bienvenu
巴黎市立大学，巴黎精神病学与神经科学研究所（IPNP），INSERM U1266，成瘾与精神障碍的遗传易感性，75014 巴黎，法国