松酸衍生物作为阿尔茨海默病多靶点药物的设计、合成与评价

《Bioorganic Chemistry》：Design synthesis and evaluation of usnic acid derivatives as multi-target drugs for Alzheimer's disease

　　

摘要
阿尔茨海默病（AD）的发病机制复杂，现有的临床药物仅能缓解症状，难以阻断疾病进程。虽然松萝酸（UA）具有抗氧化和抗炎等神经保护活性，但其抗 AD 活性受到单一靶点和血脑屏障渗透性不足等药物缺陷的严重限制。因此，本研究以 UA 为先导化合物，设计并合成了 38 个 UA 衍生物，系统评估其抗 AD 生物活性，旨在筛选多功能抗 AD 先导化合物。其中，先导化合物 S12 表现出卓越活性，其 EC?? 值为 1.24 μM，相对于母体化合物效力提高了 17.9 倍。此外，通过免疫印迹（WB）实验阐明了该化合物的潜在作用机制。结果表明，化合物 S12 通过协同调节多条信号通路发挥抗 AD 活性：它抑制 MAPK 和 NF-κB 通路的激活，以及 tau 蛋白的异常磷酸化；同时，它下调 BACE1 表达以减少 Aβ产生，并抑制 Bax/Bcl-2 通路的激活从而抑制 caspase-1 的激活，最终赋予神经保护和抗 AD 效果。测定化合物 S12 在体外血脑屏障（BBB）模型中的表观渗透系数为 7.66 × 10?? cm/s，证实了其有效穿越 BBB 的能力。进一步药理评估表明，S12 对 AD 小鼠模型的学习和记忆缺陷具有显著的改善作用。体内毒性评估显示，包括心脏、肝脏、脾脏和肾脏在内的主要器官均未观察到大体或组织病理学异常。此外，S12 显著减轻了 Aβ诱导的 AD 模型小鼠海马区的神经元病理损伤，突显了其强大的神经保护活性。综上所述，化合物 S12 表现出改善学习和记忆缺陷、增强血脑屏障渗透性和发挥抗 AD 活性的显著疗效。因此，它代表了治疗 AD 的一种极具前景的多功能治疗候选药物。

引言
阿尔茨海默病（AD）是一种慢性的、进行性的中枢神经系统神经退行性疾病。其主要特征是隐匿性、进行性记忆丧失和认知能力下降，常伴有包括行为和心理障碍以及日常生活能力受损在内的神经精神症状。作为全球最常见的痴呆症形式，AD 也是老年人痴呆的主要原因，占所有痴呆病例的约 60% 到 80% [1]。

随着全球人口老龄化加速，AD 的发病率稳步上升。据统计，65 岁及以上人群中 AD 的患病率约为 10%；而在 85 岁及以上人群中，这一数字上升至 30% 以上，突显了显著的年龄相关性增加。目前，阿尔茨海默病已成为导致生活质量下降的主要原因之一，并对公共卫生系统和社会疾病管理构成了沉重负担 [2], [3]。国际阿尔茨海默病协会估计，到 2060 年全球阿尔茨海默病患病人数可能达到 1380 万，使其成为世界各国面临的主要公共卫生挑战 [4]。中国也是全球痴呆症患病率最高的国家。据统计，2015 年中国 AD 相关的总经济负担高达 1677.4 亿美元。预计到 2030 年这一数字将急剧上升至 5074.9 亿美元——并在 2050 年进一步攀升至 1.89 万亿美元，给家庭和社会整体带来巨大且不断增长的经济压力 [5]。然而，迄今为止 AD 的发病机制尚未完全阐明。其明确的核心神经病理标志包括：(1) 由过度磷酸化的 tau 蛋白组成的细胞内神经纤维缠结（NFTs）；(2) 由异常 Aβ沉积导致的细胞外 Aβ斑块；以及 (3) 进行性突触丢失 [6], [7], [8]。

在过去的几十年里，全球众多制药公司和研究机构开展了针对 AD 新型治疗药物的广泛研发工作。然而，绝大多数候选药物在临床试验中失败，使得 AD 成为新药研发成功率最具挑战性的治疗领域之一。目前，临床上批准的 AD 治疗药物依然极其有限。一线药物主要包括乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐、利伐斯的明和加兰他敏，以及石杉碱甲、肠道菌群调节剂 GV-971 和 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂美金刚。最近，包括阿杜卡奴单抗、仑卡奈单抗和多奈单抗在内的抗 Aβ单克隆抗体也已进入临床应用 [9]。这些药物在临床应用中存在诸多局限性，且均未显示出完全治愈阿尔茨海默病的能力。鉴于该疾病高度复杂且多因素致病，针对单一分子通路的单药疗法已被证明不足以产生最佳治疗效果。因此，最有前景的治疗策略包括由作用于不同病理靶点的多种药物组成的联合方案，或开发合理设计的能够同时调节多个关键疾病相关通路的多靶点药物。在此背景下，通过分子杂交策略专门为 AD 设计的多靶点化合物代表了一种非常有前景且迅速兴起的治疗途径。

作为传统中医药的丰富宝库，天然产物在数千年的临床实践中形成了独特的理论框架，并在慢性及复杂疾病的管理中表现出显著的治疗优势。广泛的研究证实，天然产物通过多靶点、多通路调节发挥药理作用，并具有显著的神经保护特性，因此成为开发 AD 多靶点治疗药物先导化合物的宝贵来源。天然产物在神经元损伤背景下也赋予神经保护。一个突出的例子是石杉碱甲，一种从蛇足石杉科植物中分离的生物碱，表现出强大的药理活性，包括增强认知功能和强烈抑制胆碱酯酶活性 [10]。此外，小檗碱，一种异喹啉生物碱，已证明通过其抗氧化和抗炎特性，以及调节多条信号通路，改善 AD 的病理损伤并改善认知缺陷 [11]。鉴于目前可用的 AD 化学合成治疗药物无法完全治愈该病且具有明显的毒副作用 [12], [13]。近年来，天然产物及其衍生物在抗 AD 药物的研发中占据了重要地位。

地衣是地球上分布最广泛、寿命最长的生物之一 [14], [15]。UA 是地衣中发现的最丰富和最具特征性的次级代谢产物，也是人类最早识别的二苯并呋喃衍生物之一；它主要积累在属于松萝属的地衣物种中 [16]。UA 由德国科学家 Wilhelm Knop 于 1844 年首次从地衣中分离纯化 [17], [18]。越来越多的证据证实了其多样的生物活性，包括神经保护 [19]、抗菌 [20]、抗氧化 [21]、抗病毒 [22] 和抗肿瘤效应 [23]，从而突显了其在天然生物活性化合物领域的重大研究价值。值得注意的是，越来越多的证据表明 UA 及其衍生物具有抗 AD 活性 [24], [25]。例如，Shi 等人设计并合成了一系列 UA 衍生物，其中衍生物 1 和 2（图 1A）对 tau 聚集和神经炎症表现出最强的抑制作用，抑制率分别为 58% 和 52% [24]。Yang 等人开发了另一系列 UA 衍生物，其中化合物 3–6（图 1A）显示出良好的抗胆碱酯酶活性，对 AChE 和 BuChE 的最低 IC?? 值分别达到 0.269 μM 和 0.361 μM [26]。尽管上述研究初步验证了松萝酸骨架的抗 AD 潜力，但目前的衍生物仍存在显著局限性：一方面，其效力增强仍然有限，且作用机制局限于单一靶点，未能实现对 AD 涉及的多条病理通路的协同干预；另一方面，大多数研究仍处于体外筛选阶段，缺乏系统的机制阐明和全面的体内药理学评估，从而阻碍了向药物候选阶段的转化开发。因此，迫切需要进一步优化松萝酸结构，以提高其治疗 AD 的治疗价值。褪黑素是一种吲哚衍生的神经内分泌激素，表现出显著且多样的生物活性，包括强大的抗氧化 [27]、抗炎 [28]、神经保护 [29] 和抗肿瘤效应 [30]。该化合物中存在的吲哚基团已被实验验证具有明确的抗 AD 活性，因此可作为合理设计新型抗 AD 药物候选物的有价值药效团。在 AD 化学药物开发领域，他克林是 1993 年 FDA 批准用于临床的第一种治疗药物 [31]。尽管该药物已退市，但其核心药效团仍广泛用于新型抗 AD 衍生物的分子设计中。1996 年 11 月获批的多奈哌齐已成为轻中度阿尔茨海默病临床管理的一线治疗药物 [32]。相关研究证实，苄基哌啶结构基元构成了其药理活性的关键药效团。利伐斯的明随后于 2000 年获 FDA 批准，成为第三款用于轻中度 AD 治疗的市场化药物 [33]。其核心药理活性源于其分子结构内的氨基甲酸酯基团（图 1B）。

为了保留天然产物的优异药理特性并开发具有 superior 治疗疗效的抗 AD 药物，我们设计并合成了一系列带有他克林药效团的新型 UA 衍生物。上述具有经过验证的抗 AD 活性的结构片段，遵循分子杂交原则被整合到 UA 骨架中，并系统评估了目标化合物的抗 AD 活性及其潜在作用机制（图 2）。

章节片段
化学
关键中间体的合成路线概述于方案 1 中。以 4-氨基苯甲酸甲酯为起始原料，通过水解获得中间体 1a。随后，1a 在环己酮中与 POCl? 处理，并在 110°C 搅拌过夜以获得中间体 1b。最后，1b 在 120°C 回流条件下与具有不同烷基链长度的胺在 PhOH 中反应，生成目标衍生物 1c–1e。化合物 2j–2q 的合成也示于方案 1 中：

结论
在本研究中，合成并评估了 38 个松萝酸衍生物的抗 AD 活性。化合物 S12 表现出最强的神经保护活性（细胞活力：82.97 ± 5.85%），显著优于 UA（细胞活力：67.1 ± 0.83%）和多奈哌齐（细胞活力：73.04 ± 6.04%）。其 EC?? 值为 1.24 ± 0.21 μM，与先导化合物松萝酸（EC?? = 22.24 ± 1.62 μM）相比，效力提高了 17.9 倍。机制研究表明

化学
松萝酸为天然提取物，购自上海麦克林生化有限公司，纯度大于 98%。实验中使用的所有其他试剂均为化学纯，购自国药集团。用于监测反应进程的硅胶 GF254 板购自烟台黄海化学工业，用于分离纯化的硅胶板购自青岛海洋化学工业。所有化合物的 1H NMR 和 13C NMR 谱图均在...记录。

CRediT 作者贡献声明
权银生：写作 – 审阅 & 编辑，写作 – 原始草稿。刘金英：写作 – 原始草稿，形式分析。刘辉：写作 – 审阅 & 编辑。孙云霞：验证，调查。王亚兰：写作 – 审阅 & 编辑，监督。刘政：监督，数据整理。权哲山：验证，调查，资金获取。沈庆昆：项目管理，资金获取。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这可能被认为影响了本论文中报告的工作。

致谢
本研究得到了中国科学院吉林省优秀青年人才基金（编号 20250101055JJ）和国家自然科学基金（编号 82460688）的支持。

权银生 | 刘金英 | 刘辉 | 孙云霞 | 王亚兰 | 刘政 | 权哲山 | 沈庆昆
教育部长白山天然药物重点实验室，延边大学药学院，中国吉林延吉 133002