综述：异源乳蛋白表达的最新进展：从宿主工程到下游加工

《Food Bioscience》：Recent advances in heterologous lactoprotein expression: from host engineering to downstream processing

　　

摘要
全球对高质量蛋白需求的不断升级，加上传统畜牧业的环保负担，推动了微生物合成乳蛋白作为一种可持续细胞农业技术的兴起。本综述描述了增强异源乳蛋白表达的多学科方法，涵盖从宿主底盘工程到下游纯化。我们将低成本原料利用、生命周期成本和经济效益评估系统地整合为独立的核心章节，并对微生物、动物和植物细胞系统等不同表达平台进行了比较分析。翻译后修饰和表达元件优化的最新进展推动了乳铁蛋白在布氏耶氏酵母（Komagataella phaffii）中的异源生物合成，最高滴度达到 5.4 g/L。此外，随着这一进展，实现了从精制糖向包括木质纤维素生物质、粗甘油和甲醇在内的可再生原料的战略转变。值得注意的是，CO2 衍生的甲醇为负碳乳蛋白生物合成奠定了基本范式。经济分析指出下游纯化是主要的成本驱动因素，占总生产成本的 45-92%。尽管微生物合成比传统畜牧业具有显著的经济和环境优势，但必须解决这一瓶颈以实现商业可行性。采用可扩展的离子交换色谱法代替基于亲和力的方法，并结合 AI 优化的工作流程，对于实现具有成本竞争力的制造至关重要。综上所述，本综述为无动物乳蛋白制造的工业可行性、经济约束和放大挑战提供了可行的见解。

引言
蛋白质是生物体细胞结构、代谢调节和免疫功能的物质基础。因此，蛋白质摄入量直接决定个体的生长发育和健康状况。世界卫生组织（WHO）规定成人每日最低蛋白质需求量为 0.8 g/kg 体重，然而儿童、孕妇和老年人的这一需求显著增加（Willett 等，2019）。预计到 2050 年全球人口将达到 97 亿，对高质量蛋白的需求以前所未有的速度增长（Li 等，2025）。这个问题在发展中国家尤为严峻，蛋白质摄入不足仍然是导致儿童生长迟缓、成人肌肉流失的主要营养挑战。

在众多膳食蛋白来源中，乳蛋白被联合国粮农组织（FAO）和 WHO 共同指定为“高质量蛋白的基准”。这是由于它们具有完整的必需氨基酸组成和高生物利用度。乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白（Espina 等，2009），两者都富含支链氨基酸，在促进肌肉合成、增强肠道屏障和免疫反应、维持肠道微生态平衡方面发挥着重要作用。美国农业部（USDA）的最新数据显示，全球牛奶产量预计到 2026 年将达到 5.65 亿吨，同比增长 0.7%（https://www.clal.it/en/）。然而，传统乳业高度依赖畜牧业，其供应链面临多重瓶颈。奶牛养殖涉及周期长、资源消耗大：生产 1 升牛奶占用约 9.0 平方米土地，消耗 628 升淡水抽取量，并排放 3.2 千克二氧化碳当量的温室气体。这些数值显著高于豆奶等植物基替代品（Poore & Nemecek, 2018）。此外，动物流行病和抗生素滥用引起了广泛担忧。乳腺炎是最常见且频繁发生的动物疾病，直接降低产奶量和质量，严重危及奶牛健康和生产性能，全球平均临床发病率为 30.5%，经济损失率为 21%（Rasmussen 等，2024）。抗生素仍是乳腺炎的主要治疗和应急预防措施。然而，长期不合理和非规范的药物使用容易导致牛奶中抗生素残留过量，违反食品安全标准并破坏乳制品的加工稳定性。乳糖不耐受和乳蛋白过敏也限制了某些人群对乳制品的接受度：全球约 65% 的成年人患有乳糖酶缺乏症（Borralho & Marcos, 2025），儿童牛奶蛋白过敏的发病率约为 3%（Lifschitz & Szajewska, 2014）。针对这些担忧，研究人员正努力通过更便捷和通用的方法生产真实的乳蛋白，以直接解决这些现有问题。

目前，利用工程微生物合成与自然 identical 蛋白质的概念促进了“无动物乳蛋白”技术的出现。近年来，酪蛋白和乳清蛋白均成功实现了异源表达（Behm 等，2022；Ponniah 等，2010；Rosa 等，2022）。所采用的表达系统包括以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为代表的原核宿主，以及包括布氏耶氏酵母、酿酒酵母和丝状真菌在内的真核宿主。对于不同的表达宿主，有必要根据其遗传背景和蛋白分泌特性筛选和组装兼容的表达元件，以实现乳蛋白的高效异源合成。启动子是指导转录开始的核心调控序列，直接控制基因表达的幅度和时机，作为蛋白质合成效率的关键决定因素。通常，通过筛选强启动子、替换诱导型或组成型启动子可以提高目标蛋白的表达（Karbalaei 等，2020）。转录因子作为反式作用调控蛋白，介导启动子的激活或抑制；过表达正激活剂可以放大信号响应和转录强度。信号肽是短 N 端肽序列，指导新生多肽链进入分泌途径，在决定蛋白分泌效率、溶解性和正确折叠方面发挥关键作用（Deng 等，2022）。核糖体结合位点（RBS）招募核糖体并启动翻译，直接决定 mRNA 的翻译起始效率和蛋白质合成速率。通过启动子筛选、信号肽文库选择和 RBS 调节实现了表达元件的系统优化。这种综合方法显著增强了转录、分泌和蛋白质折叠，导致乳蛋白产量大幅提高（Lv 等，2023）。随后，乳蛋白基因通过精密发酵技术引入微生物中，在不参与动物的情况下实现高效表达。

在精密发酵过程中，廉价工业副产品作为原材料。包括真菌、细菌和酵母在内的各种微生物催化并将这些底物转化为高附加值产品。该过程实现了废物的高值化利用，同时降低了生产成本。近年来，微生物发酵的成本显著下降，从 2000 年的 100 万美元/kg 降至目前的约 100 美元/kg，预计到 2030 年将降至 10 美元/kg 以下（Tubb & Seba, 2021）。然而，发酵获得的粗乳蛋白需要分离和纯化以达到所需的纯度。这一步占重组乳蛋白总制备成本的 45%-92%，构成生产成本的主要部分。因此，选择合适的分离纯化技术并进行系统优化对于控制整体成本和提高经济效益至关重要。2020 年，新加坡食品局首次批准了由里氏木霉生产的重组β-乳球蛋白（β-Lg）用于冰淇淋制造。该蛋白质的氨基酸图谱与天然乳清蛋白完全一致，但不含乳糖、胆固醇或抗生素残留。一项生命周期评估研究表明，与传统牧场牛奶乳清蛋白生产相比，其发酵过程减少了多达 97% 的温室气体排放，减少了 99% 的土地占用，并将水消耗量降至约六十分之一（Piazenski 等，2024）。此外，由于发酵在封闭的生物反应器中进行，病原体微生物污染的风险显著降低。可以通过基因编辑技术去除β-Lg 的主要过敏原（如 IgE 结合表位），为乳蛋白过敏者提供安全的替代方案（Yang 等，2025）。与植物蛋白相比，发酵乳蛋白表现出优越的功能特性，如乳化性和起泡性。它们可广泛应用于医用食品、运动营养和老年膳食补充剂，填补传统乳制品无法覆盖的营养空白。未来，通过微生物发酵技术生产的乳蛋白将为行业提供一条可持续、低过敏性和高纯度的补充路径。

虽然上述内容强调了微生物乳蛋白变革性的可持续性和功能性优势，但这最终受限于低成本原料选择和优化的下游纯化这两个关键杠杆点。符合绿色低碳产业发展理念，环保原材料被优先考虑用于大规模生产。这些包括农业废弃物（如玉米秸秆、甘蔗渣）、工业副产品（如糖蜜）和可再生生物质（如木质纤维素、有机废液）。这些原材料具有来源广泛和储量丰富的特点。它们在减少废物环境排放的同时，从源头上控制了生产成本。此外，下游纯化方法直接决定生产成本和产能。从 AI 驱动的工业化到获得高纯度、高质量的蛋白质，优化色谱纯化过程对于开发经济高效的下游策略至关重要。通过多维度的原料筛选和综合经济效益评估，本文证实了乳蛋白生物制造具有重要的工业应用价值。与传统畜牧业模式相比，这种生产方法在成本控制、生产效率、产能供应和大规模生产方面显示出明显优势，表明具有广阔的发展前景。虽然最近的综述（Deng 等，2023；Nielsen 等，2024）已全面解决了牛奶蛋白分子工程策略和精密发酵的一般概况。本综述提供了独特的视角，将低成本原料利用、全流程生命周期成本核算和下游纯化经济学系统地整合为独立的核心章节。与主要强调表达优化的以往工作不同，我们比较评估了不同的主要表达平台，即微生物、真菌、哺乳动物和植物系统，并批判性地评估了下游加工施加的经济瓶颈，后者单独可占生产总成本的 92%。综上所述，这些整合的视角为克服当前的经济瓶颈并将无动物乳蛋白从实验室概念验证推向具有商业竞争力的现实提供了路线图。

片段章节

组成
牛奶是高质量蛋白的主要来源，在营养、功能和生理应用中发挥着关键作用。乳蛋白主要包括两类：酪蛋白和乳清蛋白，以及含量相对较低的乳脂球膜蛋白（L?nnerdal 等，2017）。酪蛋白约占总乳蛋白的 80%，四个酪蛋白基因位于牛染色体 6 上的一个 250 kb 基因簇中。该簇按 CSN1S1 的物理顺序排列...

细菌
在基于微生物的乳蛋白生产中，研究人员通过基因合成获得编码乳蛋白的基因。这些基因来源于人或牛序列，用于在宿主中整合或质粒表达（Deng 等，2022）。选择合适的宿主生物进行表达是获得基因后的关键步骤。宿主的选择取决于蛋白质的加工要求，并影响最终的蛋白质产量、纯度和功能（Liu 等，2023）。细菌宿主是...

表达元件
表达载体携带转录、翻译和信号传导的关键遗传元件。这些元件管理和调控合成基因线路（Ergün 等，2021；Love & Nair, 2024）。为了高效表达蛋白质，载体必须包括响应型启动子、优化信号序列、密码子优化基因、适当的终止子和抗性基因。根据宿主的遗传和细胞特征选择合适的表达元件，以最大化蛋白质产量。

原材料
微生物利用廉价底物快速生长和繁殖。这实现了更快、更高效的生产。优化原材料在成本和产量方面具有很高的研究价值。它提高了特定重组蛋白产品产量，并通过减少环境污染为循环经济做出贡献。淀粉和纤维素等廉价底物支持适中的生长速率且易于回收，从而大幅降低整体生产成本（Hammed 等，2024...

经济分析
联合国粮农组织预测，由于人口增长，到 2050 年乳制品消费量将增加 82%（Boland 等，2013）。因此，微生物乳蛋白正受到越来越多的关注。它们的味道、质地、外观、营养价值和生产成本正受到越来越多的关注。对菌株进行精细修饰以实现重组产物产量的最大化，随后进行发酵优化以实现可扩展性以及下游加工以...

结论
乳蛋白具有全面且均衡的必需氨基酸组成。它们提供高质量的营养支持，促进生长发育和身体修复。它们还具有良好的溶解性、乳化性和起泡性。这些显著改善了食品的质地、风味、口感和加工特性。因此，它们广泛应用于乳制品、肉类、烘焙食品和功能性食品中。α-乳清蛋白（α-LA）和乳铁蛋白（LF）具有多种生理活性，包括免疫...

CRediT 作者贡献声明
XiangYu Fan：监督，概念化。Li Li：写作 - 审查与编辑。

冯林杰：写作 – 审查与编辑。邱宇：写作 – 审查与编辑，写作 – 原创草稿，可视化。费康庆：监督，构思。傅山飞：监督，资金获取，构思。范晓磊：可视化，监督。郭荣波：资源，项目管理
未引用参考文献 Gündüz Ergün 等人，2019 年；Hewa Nadugala 等人，2022 年；Küllenberg de Gaudry 等人，2019 年；Mora Vásquez 等人，2025 年；Oliveira Júnior 等人，2025 年；Zhang 等人，2025 年；Zhang 等人，2024 年。
竞争利益声明
作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能被认为影响了本论文报道的工作。
竞争利益声明
作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能被认为影响了本论文报道的工作。
致谢
本研究得到了泰山学者计划（编号：tsqn202312268）和青岛市关键技术研究与开发及产业化示范项目（编号：25-1-1-gjgg-78-nsh）的支持。
邱宇 | 李力 | 冯林杰 | 范湘雨 | 范晓磊 | 郭荣波 | 费康庆 | 傅山飞
中国山东省济南市 250022 济南大学生物科学与技术学院