氢/氘交换 MALDI 质谱揭示的蛋白质发泡性与泡沫稳定性的分子决定因素

《Food Research International》：Molecular determinants of protein foamability and foam stability revealed by hydrogen/deuterium exchange MALDI mass spectrometry

　　

•HDX MALDI-MS 提供关于蛋白质结构柔性的定量信息。
•热力学结构参数与泡沫稳定性之间不存在相关性。
•泡沫稳定性与缓慢交换的 HDX 群体相关。
•泡沫稳定性与受保护蛋白质区域内的结构柔性相关。
•源自 HDX 的柔性是泡沫稳定性的一个有前景的分子描述符。

引言

泡沫是气体气泡在连续液相中的分散体，广泛用于食品工业以增强质地、口感和风味感知。例如，泡沫形成增加了体积并创造了蛋白霜特有的轻盈质地（Huang 等，2017）。泡沫通过保留香气化合物并通过减少与氧气的接触来限制氧化劣化，从而有助于啤酒质量（Mizuguchi 等，2025）。泡沫也引起了关注，作为为吞咽困难患者提供适当质地的一种手段（Lee 等，2021）。由于这些多种功能，开发具有优异发泡性能的发泡剂仍然是食品科学中的重要目标。

蛋白质是负责食物泡沫形成和稳定的主要试剂。泡沫稳定受气 - 液界面处的分子事件控制。由于蛋白质含有亲水和疏水氨基酸，它们表现出两亲性特征，并 readily 吸附到界面上。吸附后，蛋白质通常会发生部分展开，将疏水残基暴露于界面环境中（Rospiccio 等，2021）。随后吸附蛋白质之间的分子间相互作用导致粘弹性界面网络的形成，从而稳定泡沫结构（Kim & Kinsella, 1985; Li 等，2019）。根据这一机制，发泡性能预计强烈取决于蛋白质的内在物理化学特性，包括分子大小、表面疏水性和结构柔性。然而，实际上蛋白质之间的发泡性能差异很大，控制泡沫形成和稳定性的分子参数尚未被完全理解（Mitropoulos 等，2014）。

高效识别具有优异发泡性能的蛋白质对工业应用至关重要。泡沫性能通常使用表面张力和界面粘弹性等界面参数进行评估。然而，这些参数并不总是与宏观泡沫性能相关，这使得仅从界面测量难以理解泡沫行为（Wierenga 等，2023）。泡沫是分子特性影响界面行为的多尺度胶体系统，进而决定宏观泡沫性能。因此，理解分子、界面和宏观尺度之间的关系对于高效发现具有优异发泡功能的蛋白质很重要。然而，分子层面的理解仍然有限，与发泡性能相关的代表性且可靠的蛋白质描述符尚未建立，尽管已提出几种内在物理化学性质影响发泡行为。例如，据报道表面疏水性与发泡能力相关（Hill & Eastoe, 2017），而结构柔性被提议有助于界面展开，使埋藏的疏水残基暴露（Kim 等，1985）。尽管有这些见解，但检查多个物理化学参数与宏观泡沫性质之间关系的系统性研究仍然有限。建立内在蛋白质性质与发泡性能之间的定量联系，将为理性发现和设计具有改进功能的蛋白质提供一种强大的方法。

结构柔性被认为是泡沫稳定的关键因素。具有适当构象柔性的蛋白质可以在界面处重排并形成内聚的粘弹性网络（Mitropoulos 等，2014; Shen 等，2025）。然而，量化整体结构柔性的稳健且高效的方法仍然有限。氢氘交换质谱 (HDX-MS) 已成为探测蛋白质结构动力学的有力方法（Weis, 2016）。在此方法中，骨架酰胺氢在 D?O 中与氘交换，交换速率反映了蛋白质结构内的氢键和溶剂可及性。

根据 Linderstr?m–Lang 模型，HDX 通过结构开放事件发生，这些事件暂时将骨架酰胺氢暴露于溶剂中（Weis, 2016）。交换过程可以通过以下方程描述：
closeNH kop?kcl openNH kch→openND kcl?kop closeND
其中开放和关闭反应分别由速率常数 kop 和 kcl 控制，kch 是内在化学交换速率常数。NH 和 ND 分别指示氢化和氘化的酰胺。观测到的 HDX 速率常数 (kobs) 由下式给出：
kobs=kop×kchkop+kcl+kch
在天然、结构稳定条件下，折叠 (kcl) 通常比开放和化学交换都快得多 (kcl ? kop, kch)。在此机制中，kobs 简化为：
kobs=kopkcl×kch=Kop×kch
其中 Kop 是开放反应的平衡常数。因此，观测到的交换速率反映了闭合和暂时开放构象之间的平衡。蛋白质更高的结构柔性增加了此类开放事件的频率或振幅，导致更高的观测速率常数。因此，HDX 动力学提供关于蛋白质结构柔性和构象稳定性的定量信息（Houde 等，2009）。

我们已经证明 HDX-MS 可应用于研究蛋白质在界面处的结构行为（Enomoto 等，2024）。然而，传统的自下而上 HDX-MS 需要酶解和色谱分离，这限制了其通量，使其不适合筛选应用。最近，使用基质辅助激光解吸电离质谱 (HDX MALDI-MS) 的 HDX 分析已作为一种快速且高通量的替代方案被引入（Pirrone 等，2017）。然而，源自 HDX MALDI-MS 的结构参数与宏观泡沫性质之间的关系尚未得到系统性研究。

在本研究中，我们试图识别控制蛋白质发泡能力和泡沫稳定性的关键内在参数。我们使用了四种蛋白质：溶菌酶 (LYZ)、卵清蛋白 (OVA)、牛血清白蛋白 (BSA) 和人血清白蛋白 (HSA)。LYZ 和 OVA 被选为代表食品蛋白质。虽然 BSA 和 HSA 不是典型的食品蛋白质，但它们是特征良好的模型蛋白质，已被广泛用于蛋白质科学。此外，BSA 和 HSA 具有相似的晶体结构，但可以表现出不同的结构柔性和发泡性能，这使得它们成为研究通过 MALDI HDX-MS 测量的结构柔性与泡沫性能之间关系的有趣配对。我们应用了一种高通量分析方法，使用 HDX MALDI-MS 评估蛋白质结构柔性，并计算描述 HDX 的定量参数。然后我们系统检查了泡沫性质与物理化学参数（包括表面疏水性和结构柔性）之间的关系。通过相关性分析，我们识别出主要决定发泡性和泡沫稳定性的分子参数，并证明宏观发泡行为 potentially 可以与内在蛋白质性质紧密联系起来。特别是，我们表明通过 HDX MALDI-MS 评估的结构柔性可作为泡沫稳定性能的分子描述符，这可能无法被常规界面测量捕获。建立内在蛋白质性质与发泡性能之间的关系将使理性筛选功能蛋白质成为可能，而无需进行繁琐的界面测量。

部分片段

样品制备
溶菌酶 (LYZ)、卵清蛋白 (OVA) 和人血清白蛋白 (HSA) 购自富士胶片兴和纯化学株式会社（日本大阪）。牛血清白蛋白 (BSA) 购自默克（德国达姆施塔特）。在分析前进一步纯化 OVA、BSA 和 HSA 以去除如聚集体等微量杂质。OVA 使用阳离子交换色谱 (CEX) 和尺寸排阻色谱 (SEC) 的组合进行纯化。CEX 使用 ?KTAprime plus 系统 (Cytiva,

泡沫性能
本研究中检查的四种蛋白质的泡沫性能如图 1 所示。发泡性 (FA) 和泡沫稳定性 (FS) 均因蛋白质种类而异。BSA 和 HSA 表现出显著高于 LYZ 和 OVA 的 FA 值 (p < 0.05)。BSA 表现出最高的 FS，而在蛋白质中 LYZ 表现出最低的 FS (p < 0.05)。OVA 和 HSA 之间未观察到 FS 的显著差异。

发泡引起的蛋白质聚集
通过 SEC 分析评估发泡引起的蛋白质聚集。单体

结论

在本研究中，应用了高通量 HDX MALDI-MS 方法来量化蛋白质结构柔性并阐明泡沫性能的内在决定因素。通过整合结构、热力学和表面物理化学参数，我们识别了分子蛋白质性质与宏观泡沫行为之间的关系。

表面疏水性与发泡性显示出强关联性，突出了吸附动力学在泡沫形成中的核心作用。与此同时，

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CRediT 作者贡献声明
鸟居哲夫：写作 - 审查与编辑，写作 - 原稿，数据整理，概念化。小西萌：调查，数据整理。内山修：写作 - 审查与编辑，监督。

资助
本工作得到了日本学术振兴会 (JSPS) KAKENHI 基金编号 26K09602 的支持。

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作者声明，他们没有已知的可能被认为影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢
我们感谢 Edanz (https://jp.edanz.com/ac) 编辑了本手稿的草稿。

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