源自平菇的一种新型 Fe2+ 螯合肽的鉴定：结构基础、螯合机制及螯合铁在 Caco-2 细胞中的转运途径

《Food Research International》：Identification of a novel Fe2+-chelating peptide from Pleurotus ostreatus: structural basis, chelation mechanisms, and transport pathways of the chelated Fe in Caco-2 cells

　　

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  “发现了一种新型十肽（DD11），其铁螯合率为 94.25%。”
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  “Fe²⁺ 以潜在的单价 - 双齿模式与 Asp1、Asp2 和 Glu8 相互作用。”
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  “DD11-Fe 形成了一种多孔海绵状纳米结构，β-折叠含量增加。”
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  “DD11-Fe 可能通过内吞作用和细胞旁路途径提高铁的生物利用度。”

引言

铁对人类健康不可或缺，在血红蛋白、肌红蛋白及多种酶系统（如细胞色素氧化还原酶）的生物合成中起关键作用。缺铁会扰乱能量代谢，损害免疫功能，并导致缺铁性贫血（Ding 等，2024）。尽管铁可以从动物性和植物性食物中获得，但由于其生物利用度低且补充周期长，实际膳食铁摄入量仍然有限（Steinbicker & Muckenthaler, 2013）。为解决这些问题，人们开发了一系列铁强化剂，包括硫酸亚铁、乳酸亚铁和氨基酸螯合铁。然而，由于胃肠道副作用、潜在的氧化损伤以及因溶解度差而导致的生物利用度降低等缺点，它们的应用仍然受限。近年来，肽 - 铁螯合物因其副作用少、生物利用度高且具有成本效益而受到关注。多项研究报告了铁螯合肽（ICP）的分离，并利用各种食品来源蛋白（如乳清蛋白（S. et al., 2021）、驴皮胶原蛋白（Yang 等，2025）和酪蛋白（Wang 等，2022））制备了肽 - 铁螯合物。这些螯合物特别具有优势，因为它们作为完整的螯合物被吸收和利用，从而减少了抗营养因子（如草酸和植酸）对矿物吸收的竞争，进而增强了铁的生物利用度（Caetano-Silva 等，2015）。

目前，通过蛋白水解产生的 ICP 主要作为复杂混合物存在，在分子量、组成和生物活性方面存在差异。因此，通常使用超滤、凝胶过滤和离子交换色谱等多步纯化方法，以获得具有特定序列和高铁螯合能力的单组分肽。然而，这种方法通常会得到数百到数千个肽候选物，使得对每一个进行实验验证成为一项繁琐且往往不切实际的工作。近年来，研究人员将生物活性肽数据库与生物信息学工具（如分子对接）相结合，以优化目标生物活性肽（Li 等，2024）。例如，众多研究报告使用了 FragPipe、UniProt 数据库和分子对接，从加州红虫Eisenia fetida中筛选出 1700 个蛋白来源肽，具有高铁亲和力，最终确定了五个候选肽（Gaviria 等，2024）；其他研究人员使用 Peptide Ranker、AllerTOP 和分子对接筛选了 1316 个禽血血红蛋白来源肽，成功确定了两种表现出强铁螯合活性的安全肽（Guo, Ying, 等，2025）。另一方面，除了常规的化学表征方法外，分子动力学模拟因可视化肽 - 铁螯合物的结构和螯合机制而受到关注。这种方法能够实时跟踪动态结构变化，识别氨基酸螯合位点，并监测肽 - 铁结合过程中的螯合模式，从而更精确地测定螯合物结构（Zhao 等，2024）。研究人员采用这种方法研究了禽血血红蛋白来源肽与铁离子之间的相互作用（Guo, Zhou, 等，2025）；其他研究人员采用分子动力学模拟分析了肽 - 铁螯合过程中氨基酸残基和螯合模式的动态变化（Li 等，2025; Lin 等，2022a）。此外，现有研究表明 ICP 可以增强铁运输和吸收。然而，不同肽 - 铁螯合物促进铁运输的途径取决于特定的肽底物。例如，胶原肽 - 铁螯合物主要依赖二价金属转运体 1（DMT1）介导的摄取和内吞作用来增强铁运输（Li 等，2025）；鸡胚蛋黄肽 - 铁螯合物通过细胞旁路途径、内吞作用和 DMT1 介导的转运提高了铁的生物利用度（Lin 等，2025）。

Pleurotus ostreatus，作为一种食用和药用真菌，含有超过 30% 的蛋白质，这使其成为产生生物活性肽（包括抗氧化肽（Chen 等，2025）和抗菌肽（Patrzykat 等，2002））的理想来源。Pleurotus ostreatus 的特征是含有高含量的 Glu、Asp 和 His（Effiong 等，2024），这些氨基酸对铁离子具有高亲和力，从而使该真菌成为制备 IPPO 的理想材料（Zhang 等，2018）。尽管在我们之前的工作中已成功合成了 IPPO 和 IPPO-Fe，但其铁螯合能力背后的结构基础——特别是氨基酸序列和组成——仍然不清楚。此外，由于 IPPO 由异质性肽混合物组成，具有高铁亲和力的特定序列及其促进铁吸收和运输的潜在机制需要进一步阐明。

因此，首先通过超滤和阴离子交换色谱分离出表现出最大铁螯合能力的组分。随后，通过液相色谱 - 电喷雾电离 - 质谱 / 质谱（LC-ESI-MS/MS）进行肽测序，并整合生物信息学数据库和分子对接以筛选最佳肽。随后，基于包括紫外 - 可见（UV）光谱、荧光、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和¹H 核磁共振（¹H NMR）光谱在内的化学表征，进行分子动力学（MD）模拟，以阐明肽构象变化和 Fe²⁺螯合的机制细节。最终，使用 Caco-2 细胞单层模型探索了肽 - 铁螯合物对铁吸收的增强作用及其潜在机制。

章节摘要

材料

Pleurotus ostreatus 子实体购自中国陕西安康当地的一家超市。DDSPWLPEHPE（纯度 >95%）由安徽国平药业有限公司（中国安徽）合成。FeCl₂、FeSO₄、胎牛血清（FBS）、Tris-HCl 缓冲液和 CCK-8 检测试剂盒购自西安伦星化学生物试剂有限公司（中国西安）。Caco-2 细胞系购自普睿赛斯有限公司（中国南京）。邻菲罗啉二磺酸二钠盐

IPPO 的分离与纯化

使用超滤，将 IPPO（指定为 F₀）分为三个组分：F₁（<5 kDa）、F₂（5–50 kDa）和 F₃（>50 kDa）。在这些组分中，F₁ 表现出最高的铁螯合能力（81.51 ± 0.97%）（p < 0.05）（图 1A）。因此，选择组分 F₁ 进行进一步纯化。

组分 F₁ 通过阴离子交换色谱进一步分离为三个亚组分（F_1–1、F_1–2 和 F_1–3；图 1B）。其中，F_1–3 表现出最高的铁螯合活性

结论

在本研究中，从 IPPO 中分离、纯化、鉴定并筛选出了一种新型铁螯合肽 DDSPWLPEHPE。在铁螯合后，DD11 粒径减小，Zeta 电位增加，形成了有序的、致密的、颗粒状海绵结构。在 DD11 中，Trp、Asp、Glu、Ser 和 Leu 均参与了铁离子螯合，其中 NH、CO 和 COO^? 基团与铁离子形成离子键或配位键。与 FeSO₄ 相比，DD11-Fe 表现出

CRediT 作者贡献声明

王嘉豪：写作 – 审阅与编辑，软件，方法论，调查，数据管理。顾浩峰：方法论，调查，经费获取，形式分析，构思。梁磊：方法论，调查，数据管理。曾翠艳：资源，方法论。岳乐乐：软件，形式分析，数据管理。

竞争利益声明

作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了 陕西省科技项目（2026NC-YBXM-365）；“陕西大学青年创新团队”项目；安康市“揭榜挂帅”重点项目（AK2025-JBGS-03）；安康市中青年科技创新领军人才项目（AK2024PD-ZQN-07）；国家级大学生创新创业训练计划（202411397003）以及 安康学院重点项目（2022AYZD01）的支持。

我们感谢

王嘉豪 | 顾浩峰 | 梁磊 | 曾翠艳 | 岳乐乐