碱热诱导蛋白质共组装结合透明质酸表面修饰以改善豌豆蛋白的功能特性

《Food Research International》：Alkaline-heat-induced protein co-assembly combined with hyaluronic acid surface modification for improving functional properties of pea protein

　　

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  碱性热诱导蛋白质组装和透明质酸表面沉积用于豌豆蛋白改性。
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  疏水相互作用和氢键驱动三元复合物的形成。
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  豌豆蛋白的分子聚集显著减少。
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  由于结构变化，豌豆蛋白的功能特性显著改善。
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  透明质酸降低了复合蛋白的胃部消化率。

引言

近年来，日常饮食对公众健康的影响及其环境足迹已引起全球关注。依赖动物源性产品作为主要饮食成分增加了慢性病的发病率，并通过加剧畜牧业排放间接加重了环境负担 (Ismail 等，2020)。同时，植物性食品摄入不足导致营养失衡 (Auclair 等，2024)。为应对这一双重挑战，基于动植物蛋白混合的食品系统——兼具全面营养和环保特性——已获得极大关注 (Guyomarc'h 等，2021)。具体而言，利用蛋白混合物的膳食开发趋势日益增加，尤其是动物和植物蛋白的混合物 (Floret 等，2021)。混合蛋白食品最近被提议作为有前景的系统，结合了不同蛋白来源的优势，同时克服了单一蛋白配方在营养、功能、感官、成本和可持续性方面的局限性。

在各种植物蛋白来源中，豌豆因其高蛋白含量 (20–30%) 而脱颖而出 (M. Chen 等，2018)。作为豌豆淀粉加工的副产品，豌豆蛋白长期以来未被充分利用。近年来，由于其高蛋白含量、低致敏性和低成本，它引起了广泛关注。结构上，豌豆蛋白主要由球蛋白 (占总蛋白的 50–60%) 和白蛋白 (15–25%) 组成 (Rodriguez 等，2023)。11S 球蛋白是一个六聚体，分子量约为 360 至 400 kDa。每个片段包含一个重约 40 kDa 的酸性蛋白片段和一个重约 20 kDa 的碱性片段，均通过硫 - 硫键连接。该对中的酸性部分带有大约一个游离的巯基 (O'Kane 等，2004)。豌豆 7S 球蛋白是一个三聚体，分子量约为 150 kDa，其亚基可能在体外发生蛋白酶解。伴伴球蛋白 (Convicilin) 形成由约 71 kDa 亚基组成的约 290 kDa 的三聚体或四聚体 (O'Kane 等，2004)。这些富含球蛋白的结构有助于豌豆蛋白的致密聚集行为和有限的水分散性。然而，尽管其氨基酸组成相对平衡 (Ramzan 等，2026)，但豌豆蛋白是六聚体 11S 和三聚体 7S 球蛋白的混合物，天然几乎不溶于水，且表现出较差的功能特性 (Zhao 等，2024)。此外，豌豆蛋白缺乏含硫氨基酸，其可消化必需氨基酸评分为 0.88 (Guillin 等，2020)。最近的植物蛋白混合研究表明，单一植物蛋白往往存在氨基酸谱不完整和技术功能性有限的缺点，而定制化的蛋白组合可以改善营养质量和功能表现 (Etzbach 等，2025)。

与植物蛋白相比，动物源性乳清蛋白表现出高营养价值、优异的技术功能特性和生物活性 (Chatterton 等，2006)。乳清蛋白分离物主要包含β-乳球蛋白 (44–70%) 和α-乳白蛋白。β-乳球蛋白分子量为 18.3 kDa，在 pH 3–7.5 的室温下以二聚体 (~36 kDa) 形式存在；其结构包含两个二硫键和一个游离巯基 (Madureira 等，2007)。α-乳白蛋白是一种小型球形钙结合蛋白，包含四个二硫键 (Farrell 等，2004)。尽管如此，日益依赖动物蛋白可能会增加环境负担。因此，从营养和环境角度来看，结合动物和植物蛋白而不是仅依赖动物蛋白是一种有前景的策略。因此，结合豌豆蛋白和乳清蛋白有望弥补豌豆蛋白含硫氨基酸的不足，并改善其功能特性，满足创新食品在营养、功能性、消费者接受度和可持续性方面的要求 (Kristensen 等，2021)。

在豌豆 - 乳清二元系统方面已取得几项进展。研究发现，pH 调节结合豌豆蛋白和乳清蛋白的超声处理可以提高混合蛋白的溶解性和乳化性。此外，pH 调节得到的乳清蛋白分离物 (WPI) 与超声改性豌豆蛋白分离物 (PPI) 的质量比会影响混合蛋白的乳化性和乳液稳定性 (Zhao 等，2025)。然而，组装后的两种蛋白的结构 - 功能关系尚不清楚。此外，PPI 中高含量的疏水氨基酸意味着改性将不可避免地展开蛋白质结构并暴露更多的疏水基团，对重组双蛋白的长期稳定性构成了严峻挑战。在此前提下，掺入功能性多糖以与重组蛋白形成复合物，可能通过表面结构改性进一步改善双蛋白的物理化学和功能特性。透明质酸 (HA) 是一种由 N-乙酰-D-氨基葡萄糖和 D-葡萄糖醛酸重复二糖单元组成的线性阴离子多糖 (Li 等，2026)。它具有优异的保水性，以及促进水和电解质运输、关节润滑、调节血管通透性和加速伤口愈合等生物活性 (Luo 等，2024)，在生物医学领域显示出巨大的应用潜力。最近关于乳蛋白-HA 系统的研究表明，HA 可以调节蛋白质颗粒特性、表面疏水性、二级结构、流变行为和热稳定性 (Li 等，2026)，支持其作为蛋白质表面改性的功能性多糖。它现在已被批准为新食品原料。之前的研究报告称，HA 能够与乳清蛋白形成持久的结合，表现出优异物理化学特性 (Fu 等，2024)。因此，假设 HA 可以与 PPI-WPI 双蛋白系统相互作用，改性其结构，从而调节功能特性。然而，HA 与 PPI-WPI 之间的相互作用模式及其潜在的结构 - 活性关系尚不清楚。

为了克服豌豆蛋白分离物 (PPI) 固有的功能缺陷，本研究提出了一种将碱性热诱导蛋白质组装与透明质酸 (HA) 表面功能化相结合的创新双改性策略。不同于传统的单一改性方法，创造性地采用了碱性热处理和多糖表面改性的协同组合，以构建稳定的 PPI-WPI-HA 三元复合系统。具体而言，利用碱性热处理触发 PPI 和乳清蛋白分离物 (WPI) 的有序组装，形成组织良好的双蛋白骨架，而随后的 HA 表面修饰进一步优化了微观结构并改善了 PPI 的综合功能性能。本工作系统地研究了三元结构的形成机制，并阐明了其对蛋白质聚集行为、功能特性和消化特性的调节作用。研究结果为 PPI-WPI-HA 复合材料在食品工业中的实际应用和工业推广提供了可靠的理论基础。

章节摘要

材料

纯度为 80% 的豌豆蛋白分离物购自中国德州的禹王集团。纯度为 90% 的乳清蛋白分离物购自位于中国上海的源叶生物科技有限公司。分子量在 10 至 20 kDa 之间、纯度为 97% 的透明质酸购自位于中国上海的 Macklin 生物化学技术有限公司。对于实验，我们使用了活性为 3000 单位/mg 的胃蛋白酶，活性为

粒径和 zeta 电位分析

未处理的豌豆蛋白、乳清蛋白以及添加不同量 HA 的 PPI-WPI 共组装体的粒径如图 1A 所示。PPI 的粒径 (约 4800–5000 nm) 显著高于 WPI (约 200–400 nm)，表明其具有更强的疏水聚集倾向和致密的球蛋白结构，这与之前关于 PPI 聚集行为的报道一致 (Zhao 等，2024)。经过碱性热处理后，蛋白质亚基发生了

结论

碱性热诱导蛋白质组装结合多糖表面改性成功制备了 PPI-WPI-HA 三元复合物，其中组分主要通过疏水和氢键相互作用结合。这种双改性策略显著改变了豌豆蛋白的三级和二级结构，有效减少了蛋白质聚集，并在不同程度上调节了蛋白质的技术功能特性。HA 有效地延缓了胃部

CRediT 作者贡献声明

陈云南：撰写 - 原稿，调查。马晨开：撰写 - 原稿，调查。周春霞：方法论，形式分析。杨思辰：软件，形式分析。张涵：软件，形式分析。李智博：软件，形式分析。刘庆官：撰写 - 审阅与编辑，监督，项目管理，方法论，资金获取。

未引用参考文献

Chen 等，2018

Chen 等，2018

Guo 等，2025

Guo、Qi 和 Hu，2025

Jeong 和 Cho，2023

Kar 和 Bornhorst，2025

Kristensen、Christensen、Hansen、Hammershoj 和 Dalsgaard，2021

Kristensen 等，2021

Rodriguez 和 Beyrer，2023

竞争利益声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢

本工作得到了 广东省基础与应用基础研究基金 (资助编号：2025A1515110210)，以及广东海洋大学科学研究启动基金 (资助编号：060302042317) 的支持。

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