基于明胶包覆海藻酸盐的电喷雾可食用微载体用于肌肉细胞培养

《Future Foods》：Electrosprayed edible microcarriers based on gelatin-coated alginate for muscle cell culture

　　

培养肉的大规模生产需要高效、可扩展且生物相容的细胞培养系统，以支持稳健的细胞扩增和组织形成。微载体（Microcarriers）提供了一种有前景的方法，其高表面积与体积比增强了营养和氧气传输，减轻了致密组织中的传质限制。微载体设计的一个关键方面是材料的选择，必须平衡机械稳定性、可食用性和生物学功能。研究人员选择海藻酸盐（Alginate）来提供这种稳定性，可通过电喷雾参数进行调节。由于海藻酸盐本身不支持细胞粘附，研究人员应用了合适的涂层，使用明胶作为概念验证，提供用于细胞附着的生物活性RGD结构域，同时其机械强度较低。这种方法允许独立调节细胞培养和材料特性。研究人员通过电喷雾使用优化参数生产了明胶包覆海藻酸盐微载体（GA-MCs），获得了直径为242 μm的球形颗粒，并在溶胀测试中证明稳定。为了评估细胞附着和增殖，研究人员以低密度（1.6·10³ cells/cm²）和高密度（1.6·10⁴ cells/cm²）将C2C12小鼠成肌细胞和永生化牛卫星细胞（iBSCs）接种到GA-MCs上，并培养七天。在静态条件下，两种细胞类型均表现出高活力和增殖，代谢活性与常规2D培养相当。重要的是，在摇瓶系统中的初始动态培养表明，GA-MCs在搅拌条件下支持细胞附着和生长。虽然与静态条件相比增殖略有减少，但两种细胞类型均保持稳定的代谢活性，且微载体保持了其结构完整性。这些发现突出了GA-MCs在动态培养条件下的兼容性。

培养肉（Cultivated Meat）的大规模生产依赖于高效、可扩展且生物相容的细胞培养系统，以支持细胞扩增和组织形成。传统单层培养受限于低表面积-体积比，限制生产效率。微载体（Microcarriers, MCs）因其高表面积-体积比而增强营养和氧气传输，解决传质限制。然而，现有微载体多由合成材料制成，不可食用，需要额外去除步骤，降低效率并增加成本。可食用微载体虽可避免此问题，但缺乏重现性和系统控制，难以满足工业规模扩增。本研究旨在开发一种可食用、可调控的微载体系统，通过电喷雾（Electrospraying）制备明胶包覆海藻酸盐微载体（Gelatin-Coated Alginate Microcarriers, GA-MCs），独立调节机械稳定性和生物功能，并评估其在静态和动态条件下支持肌肉细胞增殖的能力。研究结果表明，GA-MCs在静态和动态条件下均支持C2C12小鼠成肌细胞和永生化牛卫星细胞（iBSCs）的附着和增殖，代谢活性与2D培养相当，动态培养中细胞增殖略有下降但保持稳定，微载体结构完整。该研究发表在《Future Foods》。

研究人员为开展研究主要用到以下关键方法：通过电喷雾系统（Spinbox, Bioinicia, Spain）制备海藻酸盐微载体，系统优化电压（15–30 kV）、流速（15–30 mL/min）和海藻酸盐浓度（0.25–0.75% w/v）以控制粒径（目标200–300 μm）和分布；随后用8%明胶涂层，并用京尼平（Genipin）交联；采用激光衍射粒径分析仪（Mastersizer, Malvern Panalytical, UK）和扫描电镜（SEM）表征微载体尺寸、形貌和溶胀行为；使用C2C12细胞（购自DSMZ）和iBSCs（购自Applied Biological Materials Inc.）进行细胞附着和增殖实验，在静态和动态（摇瓶，60 rpm）条件下培养7天，通过PrestoBlue? assay、葡萄糖/乳酸分析试剂盒和活死染色（AO/PI）评估细胞活力和代谢。

3.1 电喷雾生产与优化海藻酸盐微载体：通过系统调节电压、流速和海藻酸盐浓度，研究人员发现粒径随浓度增加而减小（平均d_0.5从330 μm降至289 μm），高电压下粒径增大（与流速交互作用），低流速产生较小粒径。优化条件为0.75%海藻酸盐、30 kV、15 mL/min，获得粒径242 μm、跨度0.827的微载体，形状均匀、重现性好。

3.2 明胶-海藻酸盐微载体的开发：明胶涂层后，C2C12细胞在GA-MCs上附着并呈现铺展形态，而未经涂覆的A-MCs上细胞保持球形未附着，表明明胶中的RGD序列促进整合素介导的细胞粘附。京尼平交联使微载体呈蓝色，证实成功交联，灭菌后结构未受损。

3.3 微载体的表征：溶胀测试显示，在生理条件（DMEM, 37°C, 5% CO₂）下，未涂覆A-MCs在7天内直径增大40%，而GA-MCs仅增大29%，明胶涂层减少Na⁺置换Ca²⁺引起的离子交换，提高稳定性。SEM显示细胞-游离微载体表面多孔皱缩，细胞附着后出现光滑区域和细胞突起，证明成功粘附。

3.4 微载体上C2C12和iBSC的静态培养：在低（10³ cells/well）和高（10⁴ cells/well）接种密度下，两种细胞在GA-MCs上代谢活性（PrestoBlue荧光）持续增加，与组织培养塑料（TCP）相当。葡萄糖消耗和乳酸产生表明代谢活跃，且细胞在7天内形成密集聚集体，活死染色显示高活力（几乎无死细胞），证明GA-MCs支持细胞附着和增殖。

3.5 微载体上C2C12和iBSC的动态培养：在摇瓶动态条件下，两种细胞持续生长，但增殖率和代谢活性略低于静态条件（葡萄糖消耗和乳酸产生减少）。显微镜观察显示细胞桥和跨微载体聚集体形成，微载体结构完整。这证明GA-MCs在剪切力下保持稳定，支持细胞附着，但需进一步优化搅拌速度等参数。

讨论部分总结了明胶涂层改善粘附但血清蛋白可能贡献，建议未来研究无血清条件；动态培养中生长降低可能归因于剪切力，但微载体结构完整性证明其可扩展潜力；系统局限性包括血清依赖性和工艺规模，但电喷雾可扩展性（如多喷嘴系统）提供了解决途径。研究结论部分翻译如下：本研究开发并评估了明胶包覆海藻酸盐微载体（GA-MCs），作为可扩展、生物相容且可食用的肌肉细胞培养平台，用于培养肉生产。通过电喷雾建立了可调制造工艺，生成尺寸可控（200–300 μm）、分布窄、形态可重现的球形微载体。明胶涂层显著改善细胞粘附，支持C2C12小鼠成肌细胞和iBSCs在7天内高效附着、铺展和增殖，代谢活性与2D培养相当。在摇瓶动态条件下，微载体支持细胞扩增，尽管增殖速度略有降低，但细胞活力和代谢稳定，表明其适用于可扩展生物反应器系统。尽管存在血清依赖性等局限性，GA-MCs为可食用细胞扩增提供了可重现且多功能的途径，代表向可扩展培养肉生产过程迈出的重要一步。