结合带硬度增加与血清小细胞外囊泡蛋白质组学特征在子宫腺肌症相关不孕症中的表现：一项探索性剪切波弹性成像与蛋白质组学研究

《International Journal of Women's Health》：Increased Junctional Zone Stiffness and Serum Small Extracellular Vesicle Proteomic Signatures in Adenomyosis-Associated Infertility: An Exploratory SWE and Proteomic Study

　　

背景：本研究提出了一种非侵入性方法，结合剪切波弹性成像（SWE）测量结合带（JZ）硬度和血清小细胞外囊泡（sEV）蛋白质组学，以探索子宫腺肌症相关不孕症（adenomyosis-associated infertility, AM+INF）的分子改变。方法：研究人员使用SWE测量子宫腺肌症相关不孕症患者（n=16）和健康对照（n=8）的JZ硬度。进行了探索性机器学习分析，使用支持向量分类器（support vector classifier, SVC）和基于SHAP的可解释性。对于蛋白质组学发现分析，从每组中随机选择四个样本。从两组中分离血清sEV，进行表征，并进行了蛋白质组学分析。结果：SWE测量显示，子宫腺肌症相关不孕症患者的JZ剪切波速度（shear wave velocity, SWV）显著增加，表明组织硬度增加。血清蛋白质组学分析发现，与健康对照相比，子宫腺肌症相关不孕症患者中有37个下调蛋白（发现队列，每组n=4）。基因本体（GO）富集分析突出了关键术语，如中胚层发育、细胞-基质粘附和胶原结合。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析确定了显著通路，包括细胞外基质（ECM）-受体相互作用和PI3K-Akt信号传导。分子特征数据库（MSigDB）C2富集分析显示ECM和细胞粘附相关通路的一致富集，涉及GRB2、ANGPT1、ITGA5和ITGB1，所有这些蛋白在子宫腺肌症相关不孕症组中均较健康对照组下调。结论：ECM相关蛋白失调伴随JZ硬度增加，突出了SWE作为评估该疾病子宫变化的非侵入性方法的潜力。这些发现是初步和探索性的，需要在更大的独立队列中进行验证，并且不能得出因果、诊断或机制性结论。

本研究以子宫腺肌症相关不孕症（adenomyosis-associated infertility, AM+INF）为研究对象，探讨了结合带（junctional zone, JZ）硬度与血清小细胞外囊泡（small extracellular vesicle, sEV）蛋白质组学特征之间的关联。研究背景：子宫腺肌症是一种雌激素依赖性良性妇科疾病，其特征为子宫肌层内出现异位子宫内膜腺体和间质。尽管传统上认为子宫腺肌症多见于经产妇，但越来越多的证据表明，该病在不孕女性中亦常见，并可能对自然生育能力和辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）结局产生不利影响。然而，子宫腺肌症与生殖结局之间的关系仍存争议，部分原因在于诊断标准、疾病表型和研究人群的异质性。从生殖角度看，AM+INF不应简单等同于子宫腺肌症本身，其机制可能涉及子宫内膜容受性受损、子宫异常蠕动、慢性炎症、纤维化和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑。子宫结合带位于子宫内膜和子宫肌层之间，与胚胎着床和生殖功能高度相关。在子宫腺肌症中，JZ的增厚、不规则和结构扭曲已被认为与生育力下降和较差的ART结局相关。然而，仅凭形态学异常可能无法完全捕捉JZ的功能和生物力学改变，如纤维化、平滑肌功能障碍和ECM相关组织重塑。因此，超越形态学评估，评估JZ的生物力学特性可为AM+INF相关的子宫功能改变提供额外见解。超声弹性成像，特别是剪切波弹性成像（shear wave elastography, SWE），可无创定量评估组织硬度，并已越来越多地应用于妇科疾病。小细胞外囊泡是携带蛋白质、脂质和核酸的膜结合囊泡，介导细胞间通讯，且累积证据表明sEV参与生殖过程，包括配子成熟、受精、胚胎发育和着床，sEV介导的通讯改变可能与生殖障碍相关。然而，有关AM+INF女性中血清sEV蛋白质组学改变的证据仍有限。因此，整合JZ-SWE与血清sEV蛋白质组学可能有助于表征与AM+INF相关的互补生物力学和分子特征。研究人员开展了什么研究：本研究共纳入16例AM+INF患者和8例健康对照（healthy controls, HC），通过SWE测量JZ硬度，并随机选取每组4例进行血清sEV蛋白质组学发现分析，其余样本用于探索性酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）验证。利用机器学习模型（支持向量机，support vector machine, SVM）和SHAP（Shapley additive explanations）进行特征选择与解释。得出什么结论：研究发现，AM+INF患者的JZ硬度显著增加，血清sEV中37个蛋白下调，富集于ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路，其中GRB2、ANGPT1、ITGA5和ITGB1等候选蛋白下调。这些结果提示ECM相关蛋白失调与JZ硬度增加并存，凸显了SWE作为非侵入性评估子宫变化的潜力。但需注意，这些发现为探索性结果，需在更大独立队列中验证，不能得出因果、诊断或机制性结论。论文发表在《International Journal of Women's Health》。

关键技术方法：样本队列来源于福建医科大学附属第二医院辅助生殖中心和超声医学科，2024年1月至2025年8月连续招募。主要技术方法包括：SWE测量JZ硬度（使用Mindray Nuewa R9系统，2-9 MHz腔内探头，测量JZ剪切波速度）；血清sEV分离（离心法），通过纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）、纳米流式细胞术（NanoFCM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）进行表征；蛋白质组学分析采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行数据非依赖性采集（DIA）；机器学习分析使用L1正则化逻辑回归进行特征选择，结合SMOTE（Synthetic Minority Over-sampling Technique）过采样和SVM分类，并通过SHAP进行模型解释；ELISA用于候选蛋白的初步验证。

研究结果：
1. **子宫内膜和结合带弹性在AM+INF和HC中的比较**：通过SWE测量，JZSWV_min、JZSWV_mean、ENSWV_mean和ENSWV_min在AM+INF组显著高于HC组（均P<0.05），表明JZ和子宫内膜硬度增加。SWE测量表现出良好的观察者内和观察者间重复性（ICC>0.90）。
2. **特征选择与机器学习分类性能**：基于L1正则化逻辑回归，从7个有显著差异的超声和SWE变量中筛选出3个特征：子宫大小、ENSWV_mean和JZSWV_min。SVM模型在内部测试集（n=8）中达到AUC 0.933（95% CI: 0.625-1.000），准确率0.875，敏感性0.800，特异性1.000。置换检验显示模型性能优于随机标签（P=0.0099）。
3. **SHAP模型解释**：SHAP分析显示JZSWV_min是最具影响力的特征，其次是ENSWV_mean和子宫大小。较高特征值倾向于增加AM+INF分类的输出。
4. **血清sEV表征与蛋白质组学概览**：NanoFCM和TEM证实了sEV的典型大小（30-150 nm）和形态，sEV浓度在两组间无显著差异。蛋白质组学共鉴定出1,739个共有蛋白，16个AM+INF特异性蛋白，21个HC特异性蛋白。
5. **差异血清sEV蛋白质组学分析**：根据预设探索性标准（FC>1.2或<0.83，名义P<0.05），鉴定出100个候选差异蛋白，其中63个上调，37个下调。FDR校正后无蛋白保持显著。下调蛋白的GO富集分析显示与中胚层发育、细胞-基质粘附、胶原结合相关；KEGG分析富集于ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路。PPI网络和cytoHubba分析将GRB2鉴定为枢纽蛋白。
6. **MSigDB C2富集分析与探索性ELISA验证**：下调蛋白富集于5个ECM和粘附相关通路，涉及GRB2、ANGPT1、ITGA5和ITGB1，这些蛋白在AM+INF组中均下调。ELISA进一步验证了ITGB1的显著下调（P<0.05），GRB2和ITGA5呈下降趋势但未达统计学意义。

讨论部分总结：讨论指出，JZ硬度增加与血清sEV蛋白组学改变并存，涉及ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路。SWE可能为AM+INF提供非侵入性生物力学评估，但需注意对照组仅为健康女性，缺乏疾病对照组（如无子宫腺肌症的不孕女性和无子宫腺肌症的不孕女性），且血清sEV来源多元，不能直接反映子宫局部变化。研究局限性包括样本量小、无病理确诊、未区分月经周期亚时相等。研究结论翻译：这项探索性研究表明，子宫腺肌症相关不孕症伴随有结合带硬度增加和血清小细胞外囊泡蛋白质组学改变，涉及细胞外基质相关和PI3K-Akt信号通路。这些发现可能为未来研究子宫腺肌症相关不孕症中子宫生物力学与分子失调之间的关系提供基础，但并未建立因果关系。在剪切波弹性成像参数或血清小细胞外囊泡蛋白被视为诊断或临床适用的生物标志物之前，需要更大规模、周期控制、临床分层的队列并进行独立验证。