小胶质细胞中的昼夜节律以性别特异性方式介导早期生命突触发育

《Cell Reports》：Circadian rhythms in microglia mediate early life synaptic development in a sex-specific manner

　　

如今，儿童因夜间屏幕使用和不规律睡眠而普遍经历昼夜节律紊乱，但内部时钟如何塑造大脑发育尚不清楚。青春期是一个关键窗口期，此时突触连接性得到精细调整，部分由吞噬突触元件的小胶质细胞（microglia）介导。在此，在青春期小鼠中，研究人员表明海马小胶质细胞表现出昼夜节律转录（diurnal transcriptional rhythms），其中突触修剪（synaptic pruning）基因表达在休息阶段达到峰值。在早期生命中诱导性删除小胶质细胞中的核心时钟基因Bmal1会消除这些节律，并以性别依赖性方式改变发育中的海马突触（hippocampal synapses）。在雄性中，时钟破坏增加了突触吞噬，减少了树突棘密度（dendritic spine density），并降低了突触连接性；雌性表现出类似的突触连接性降低，但没有明显的突触后结构变化。小胶质细胞时钟破坏还诱导了广泛的、性别特异性的突触相关基因表达变化，这些变化与神经发育障碍（neurodevelopmental disorder）通路重叠，并导致记忆和社交能力受损，表明小胶质细胞时钟是发育性突触精炼的关键调节因子。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
儿童普遍面临夜间屏幕使用和睡眠不规律导致的昼夜节律紊乱，但内在生物钟如何影响大脑发育仍不清楚。青春期是突触连接精细调整的关键窗口，小胶质细胞（microglia）通过吞噬突触元件参与这一过程。成年小胶质细胞已显示具有昼夜节律，但发育阶段小胶质细胞的节律功能及其对神经回路形成的影响尚未明确。本研究旨在探索小胶质细胞内在时钟是否在早期大脑发育中调控突触修剪，并揭示其破坏对神经环路和行为的影响。

**研究内容与结论**
研究人员利用他莫昔芬诱导的、小胶质细胞特异性Bmal1条件敲除小鼠模型（Tmem119-CreERT2;Bmal1^fl/fl），在青春期（P24-40）小鼠中进行研究。结果显示，海马小胶质细胞在青春期早期即表现出昼夜节律转录活性，其中突触修剪基因在休息相（白天）高表达。Bmal1敲除消除这些节律，并以性别特异性方式改变发育中的海马突触：雄性小鼠突触吞噬增加、树突棘密度降低、自发兴奋性突触后电流（mEPSC）频率下降；雌性小鼠则表现为突触连接性降低但无突触后结构变化。同时，小胶质细胞时钟破坏导致广泛的性别特异性基因表达变化，这些变化与神经发育障碍（如自闭症、精神分裂症）风险通路重叠，并损害物体识别记忆和社交能力。该研究发表于《Cell Reports》，揭示了小胶质细胞时钟作为发育性突触精炼关键调节因子的机制，为理解昼夜节律紊乱影响神经发育的性别差异提供了细胞层面证据。

**主要关键技术方法**
研究采用小鼠模型，实验小鼠来源于Tmem119-CreERT2（JAX#031820）与Bmal1^flox（JAX#007668）杂交，诱导幼崽（P3-5）小胶质细胞特异性Bmal1敲除。关键技术包括：RNA测序（微胶质细胞和海马CA1区微穿刺组织）分析昼夜转录节律及差异表达基因；免疫组化（IBA1、CD68、PSD-95共定位）量化小胶质细胞突触吞噬；脑片全细胞膜片钳电生理记录（mEPSC、诱发EPSC及配对脉冲比）评估突触功能；Confocal显微镜结合Imaris 3D重建分析树突棘形态；行为学测试（新物体识别、三箱社交、高架十字迷宫）评估记忆、社交和焦虑样行为。此外，采用Sholl分析量化小胶质细胞分支复杂性，以及RRHO（秩秩超几何重叠）分析比较基因表达一致性。

**研究结果**
**小胶质细胞在青春期表现出Bmal1依赖的昼夜转录活性差异**
通过分离P28野生型小鼠海马小胶质细胞进行RNA测序，发现1358个基因（13%）在ZT6（光照中期）与ZT18（黑暗中期）间差异表达。白天高表达基因富集于促炎免疫激活、抗原呈递和小胶质细胞吞噬通路，夜间高表达基因富集于线粒体维持和能量稳态。突触吞噬基因（如Cx3cr1、C1qa、C3ar1、Sirpa）在白天高表达。Bmal1条件敲除后，86%的昼夜节律基因表现出显著的基因型×光暗相互作用，昼夜表达差异被消除，但平均表达水平不变。RRHO分析显示，雄性和雌性野生型小胶质细胞昼夜基因表达高度一致，且Bmal1敲除对雄性和雌性的影响也相似。

**小胶质细胞核心时钟破坏损害物体识别记忆和社交能力**
在P24-31进行行为测试。新物体识别测试中，Bmal1条件敲除小鼠（Bmal1 cKOMG）的雄性和雌性对新物体的探索时间均减少，表明物体识别记忆受损。三箱社交测试中，Bmal1 cKOMG小鼠对社交室的偏好降低，表明社交能力减弱。高架十字迷宫测试显示，Bmal1 cKOMG与野生型小鼠在开放臂时间、总运动距离上无差异，排除焦虑或运动能力变化的影响。

**小胶质细胞Bmal1敲除诱导雄性而非雌性小鼠的吞噬和形态变化**
在P30进行免疫组化分析海马CA1区。小胶质细胞数量无差异，但雄性Bmal1 cKOMG小鼠的CD68阳性吞噬溶酶体中PSD-95共定位体积百分比和总共定位体素数均增加，表明突触吞噬增强。雌性无显著变化。Sholl分析显示，雄性Bmal1 cKOMG小胶质细胞在距胞体10-20μm处分支数量减少，雌性无差异，表明雄性小胶质细胞分支复杂性降低。

**小胶质细胞时钟调节雄性小鼠海马树突棘密度和形态**
通过离体膜片钳记录并填充神经生物素，对CA1锥体神经元进行树突棘3D重建。雄性Bmal1 cKOMG小鼠树突棘密度降低，尤其是丝状伪足、短粗和长薄型棘，而蘑菇型棘无差异。雄性Bmal1 cKOMG小鼠的短粗、长薄和蘑菇型棘体积均减小。雌性无脊柱密度或体积变化。

**雄性青春期小鼠自发突触活动在小胶质细胞时钟破坏后减少**
记录mEPSC显示，Bmal1 cKOMG小鼠mEPSC频率降低（主效应），幅度无显著差异。累积概率分布显示，雄性Bmal1 cKOMG小鼠频率左移，幅度分布变窄，雌性无变化，表明频率降低主要受雄性驱动。

**小胶质细胞时钟破坏改变雄性和雌性青春期小鼠的诱发突触活动**
刺激Schaffer侧支记录诱发EPSC，Bmal1 cKOMG小鼠（雄性和雌性）的诱发反应幅度降低，半宽增大。配对脉冲比（PPR）在50ms刺激间隔时呈升高趋势，提示突触前释放概率降低。这些变化在雄性和雌性中均出现，但雄性效应更明显。

**小胶质细胞时钟敲除诱导海马突触相关通路的性别不一致基因表达变化**
对P28 CA1区微穿刺组织进行RNA测序，发现Bmal1 cKOMG小鼠（无论性别）存在广泛的基因表达变化，上调通路包括Eph-Ephrin信号、Wnt信号和Rho GTPase信号，下调通路包括微管/肌动蛋白过程和少突胶质细胞发育。RRHO分析显示大量性别不一致的基因表达，雄性上调而雌性下调的基因包括突触结构基因（如Shank2）和指导分子（如Plexins）。通路分析表明，雄性Bmal1 cKOMG更倾向于上调突触结构/可塑性通路，雌性则上调非突触通路。

**小胶质细胞时钟敲除诱导神经发育障碍风险通路的性别特异性变化**
将Bmal1 cKOMG海马差异表达基因（DEGs）与Geisinger发育性脑疾病数据库中的神经发育障碍（NDD）风险基因集比较，发现性别不一致的DEGs（雄性上调、雌性下调）与自闭症、精神分裂症、注意力缺陷/多动障碍、智力残疾、癫痫和脑瘫六大NDD风险基因显著重叠，但不包括双相情感障碍。10个在所有六种NDD中保守的基因在雄性Bmal1 cKOMG中过表达，富集于MECP2转录调控和MECP2神经元受体/通道调节通路。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，小胶质细胞在早期生命即表现出昼夜节律，其破坏导致突触网络发育异常，且雄性和雌性通过不同的分子和结构机制达到相似的行为缺陷，体现了神经系统“简并性”原则。小胶质细胞时钟失调诱导的基因变化与NDD风险基因重叠，提示昼夜节律紊乱可能通过小胶质细胞介导的突触精炼异常增加NDD风险，尤其影响雄性。研究结论为：小胶质细胞内在时钟在发育早期通过调控突触修剪的昼夜节律，优化突触组织；其破坏通过性别特异性方式改变神经回路，损害记忆和社交能力，突出了小胶质细胞时钟在塑造发育大脑中的关键作用。