跨脊椎动物单细胞和空间图谱揭示胃肠道细胞创新的进化轨迹

《Cell Genomics》：A cross-vertebrate single-cell and spatial atlas reveals evolutionary trajectories of gastrointestinal cellular innovation

　　

脊椎动物胃肠道多样化的细胞创新在很大程度上仍然未知。在此，研究人员构建了一个单细胞和空间转录组图谱，包含来自10个物种的近100万个细胞，跨越了5亿年的脊椎动物进化。对保守基因共表达模块的分析表明，现有遗传程序的重新利用，以及新基因的出现，驱动了细胞进化。研究人员将模块重塑与谱系特异性动态联系起来，包括纤毛细胞丢失和簇细胞出现。此外，研究人员在肺鱼中发现了淋巴聚集体，表明肠道免疫组织可能早于四足类谱系，并证明鱼的胃酸细胞（oxynticopeptic cells）表现出功能极化，预示了哺乳动物的胃特化。该图谱提供了胃肠道进化的全局视图，突出了调控重新利用在定义器官功能中的作用。

**研究背景与问题**
脊椎动物胃肠道（gastrointestinal tract, GI）负责营养消化、上皮屏障维持和免疫监视。尽管在脊椎动物进化中已记录了解剖学创新，但驱动这些转变的分子和细胞机制尚不明确。传统方法如解剖学和原位杂交缺乏分子分辨率，无法重建进化轨迹，且基于低分辨率或有限标记的方法可能不准确地描绘进化路径。例如，解剖学和原位杂交研究在非洲肺鱼肠道中检测到淋巴样结构，但CD3E和IGH共染色未显示T/B细胞分离，提示缺乏功能性生发中心。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（如Stereo-seq）提供了前所未有的分辨率，但现有图谱主要集中于模式哺乳动物，强调发育、组织、再生等，缺乏进化视角。尽管存在一些“低等脊椎动物”GI图谱，但它们并非为进化研究设计。因此，跨物种GI图谱的构建面临重大挑战，包括细胞类型的进化定义和跨物种整合的技术困难。研究人员开展这项研究旨在解码脊椎动物胃肠道细胞创新的进化轨迹，填补从无颌类到哺乳动物的系统发育空白。

**研究人员开展的研究**
研究人员整合了scRNA-seq和Stereo-seq数据，从10个代表性物种（包括白斑竹鲨、非洲肺鱼、灰多鳍鱼、美国匙吻鲟、鳄雀鳝、海洋青鳉、非洲蝴蝶鱼、大西洋大海鲢、七鳃鳗和人类）中获得934,144个高质量细胞，覆盖约5亿年的脊椎动物进化。他们开发了一种三部分整合框架，结合SAMap、CellHint和基于scVI的ortho-type分析，克服了单一方法的局限性，从而解析了细胞类型的分子系统发育。通过整合Hotspot共表达分析、OrthoFinder直系同源基因分组和castor祖先重建，他们鉴定了保守和动态的基因模块，并利用保守共表达模块（CCM）作为“核心调控复合物”（CoRC）的代理，解码调控进化。该研究发表在《Cell Genomics》。

**主要技术方法**
研究人员采用了scRNA-seq（DNBelab C4系统）和Stereo-seq空间转录组学技术。样本来源包括8种鱼类（来自商业鱼商）和公共数据（七鳃鳗来自Pang等人，人类来自Oliver等人）。关键数据分析方法包括：三部分整合框架（SAMap用于跨物种成对整合，CellHint用于跨器官注释感知整合，scVI用于无注释整合生成ortho-types）；CCM分析通过Hotspot鉴定基因模块，结合OrthoFinder直系同源基因分组和castor祖先状态重建；空间解卷积使用Tangram和RCTD；荧光原位杂交（FISH）用于验证空间分布。

**研究结果摘要**
**跨脊椎动物胃肠道单细胞和空间图谱**：研究人员构建了包含10个物种、4个器官系统的综合图谱，通过Stereo-seq定义了11个空间域，并与组织学和解卷积结果一致。三部分整合策略稳健地实现了跨物种整合，将细胞类型分为三个主要区室（免疫、基质、上皮），并重建了细胞分辨率进化树。上皮区室表现出器官特异性转录可塑性，而基质和免疫区室高度保守。全基因组复制（WGD）事件分析显示，胃上皮利用最高比例的第二轮WGD衍生基因。

**跨脊椎动物系统发育中GI细胞程序的进化动态**：层次树状图识别出12个细胞群。三个细胞群（间充质、内皮、肠内分泌细胞）表现出高度保守性，其CCM反映了核心功能。CCM分析表明，肠内分泌细胞CCM由49个基因组成，包含PAX6、FEV、NEUROD1等转录因子，并通过旁系同源替代维持功能稳定性。迷路细胞和BEST4⁺细胞的出现与WGD事件后的基因获得和模块组装有关。免疫区室显示分层进化动态：古老ortho-type（如淋巴和髓系）全脊椎动物保守；鱼类髓系分化为两个ortho-type；B细胞在鱼类中保留吞噬功能而在哺乳动物中丢失；人类T细胞形成新ortho-type。

**肺鱼淋巴结构的进化创新**：肺鱼T细胞同时占据鱼类样（ortho-type 0）和人类样（ortho-type 5）状态，提示其处于中间进化状态。研究人员推断出肺鱼和人类共有的29基因CCM，富集于细胞粘附分子相互作用等通路。空间转录组学在肺鱼肠道中识别出五个淋巴聚集体（LA1-5），其中最大的LA1显示T/B细胞区域分离，类似于哺乳动物淋巴结，而LA2-5显示混合分布。FISH验证了CD3E⁺ T细胞和CD79A⁺ B细胞的空间分离。邻域分析将LA1与其他LA区分开，并映射到人类淋巴结效应T细胞区。空间热点分析识别出四个与LA相关的基因模块，参与LA起始、生发中心、T细胞激活和抗原呈递。

**鱼类特异性上皮细胞的进化和功能特征**：纤毛细胞和胃酸细胞（oxynticopeptic cells）是鱼类特有的上皮细胞类型。纤毛细胞在七鳃鳗、多鳍鱼、匙吻鲟、肺鱼等物种的肠或胃中检测到，其保守的15基因CCM在组织依赖性方式下存在，当细胞类型丢失时CCM相应消失。胃酸细胞在功能胃的鱼类中保守，共表达ATP4A和PGC，其CCM在人类中分裂为两个独立模块（壁细胞和主细胞），并招募新基因。空间转录组学显示胃酸细胞位于胃腺中，并存在亚型分化。

**鱼类胃酸细胞亚型的鉴定**：通过scRNA-seq和SAMap整合，研究人员在六种有功能胃的鱼类中识别出两种保守的胃酸细胞亚型：壁细胞样（parietal-like）和主细胞样（chief-like）。壁细胞样亚型富集于线粒体活性和能量代谢，主细胞样亚型富集于蛋白质合成。假时间分析揭示了从ATP4A^high壁细胞样前体到PGC^high主细胞样状态的分化轴。空间转录组学在鲨鱼胃中显示这些亚型在胃腺内的清晰分区。

**讨论与结论**
该跨脊椎动物GI图谱整合了10个物种的单细胞和空间转录组数据，覆盖5亿年进化，填补了无颌类到哺乳动物的空白。CCM框架通过祖先重建定义保守基因网络，作为CoRC的代理。结果表明，细胞模块重新利用（modular repurposing）是驱动脊椎动物GI进化的主要机制，辅以新基因出现。研究在间充质、内皮和肠内分泌细胞中解析了深度保守的程序，而上皮和免疫区室通过CCM重塑表现出进化可塑性。肺鱼肠道中淋巴结样结构的发现提供了黏膜免疫进化的“缺失环节”，揭示了从鱼类弥散性免疫到哺乳动物组织化淋巴结构的过渡。该研究建立了“模块重新利用”作为复杂器官进化的范式，为理解黏膜免疫起源和上皮失调提供了见解。