排斥导向分子-A调节中枢神经系统自身免疫中的中性粒细胞相关Th17反应

《Frontiers in Immunology》：Repulsive guidance molecule-a regulates neutrophil-associated Th17 responses in CNS autoimmunity

　　

背景与目的：排斥导向分子-A（RGMa）以在T细胞介导的神经炎症与中枢神经系统（CNS）修复中的作用而著称。先天-适应性免疫互作，尤其是中性粒细胞与Th17细胞之间的互作，正成为多发性硬化（MS）神经炎症病理的关键驱动因素。RGMa是否调节这些中性粒细胞相关Th17反应在很大程度上未知。阐明该机制可能揭示MS的新治疗靶点。方法：在10例复发缓解型MS（RRMS）患者急性发作期与缓解期及10例健康对照中检测血清RGMa、BMP4、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、IL-17A及炎症标志物水平；采用原代人中性粒细胞与CD3+ T细胞transwell共培养评估RGMa单克隆抗体（RGMa-mAb）对中性粒细胞活化、Th17相关反应及T细胞迁移的影响；在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中以RGMa-mAb干预，评估体内神经炎症与BMP4-SMAD相关信号变化。结果：急性期MS患者血清RGMa与NE较缓解期及健康对照升高（p < 0.05），IL-17A较健康对照升高（p < 0.05）；RGMa与NE正相关（r = 0.71），血清Ly6G6D与IL-17A正相关（r = 0.66）。体外RGMa-mAb减弱PMA诱导的中性粒细胞活化、降低Th17相关炎症反应并抑制T细胞迁移。EAE小鼠中RGMa-mAb改善神经功能缺损、降低中性粒与Th17相关炎症标志物并调节BMP4-SMAD信号。结论：RGMa参与CNS自身免疫中的中性粒细胞相关Th17炎症反应，可能与BMP4-SMAD信号相关；靶向RGMa或可作为MS相关神经炎症的潜在治疗策略。

研究背景与立项依据

多发性硬化（MS）是青年成人非创伤性神经残疾的主要病因，其病理以固有免疫与适应性免疫细胞共同浸润CNS、介导髓鞘与轴突损伤为核心。其中Th17细胞通过分泌IL-17等促炎因子放大CNS炎症，而中性粒细胞经中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及可溶性介质促进组织损伤，两者构成“中性粒细胞–Th17轴”正反馈环路。排斥导向分子-A（RGMa）原属轴突导向分子，近期被证实可增强T细胞黏附、促进致病性Th17反应，并通过BMP信号调节免疫活化，但RGMa是否桥接中性粒细胞与Th17互作仍不清楚。研究人员假设RGMa通过调控中性粒细胞相关Th17免疫互作参与CNS自身免疫，据此联合临床样本、体外共培养与EAE模型开展机制探索。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。

主要关键技术方法

研究人员构建三类证据链：临床端纳入中日友好医院10例RRMS患者（急性发作期与治疗≥3个月后缓解期配对血清）及10例年龄性别匹配健康对照，定量RGMa、BMP4、NE、Ly6G6D、IL-17A、IFN-γ；体外端采用健康人原代CD3⁺ T细胞与中性粒细胞以3 μm孔径transwell分隔共培养，设空白、PMA活化、PMA+RGMa-mAb三组，结合流式、ELISA、RT-qPCR与迁移实验；体内端以C57BL/6雌鼠MOG_35–55诱导EAE，尾静脉给RGMa-mAb（10 mg/kg，每周一次共两周），行神经评分、H&E、免疫荧光、TUNEL、Western blot、co-IP与qPCR。样本队列来源以上已注明，试剂与常规培养操作从略。

研究结果

3.1 急性期MS患者血清RGMa、IL-17A与NE升高

研究人员检测发现急性期RGMa、NE、IL-17A均高于健康对照，RGMa与NE高于缓解期；相关分析显示急性期RGMa-NE强相关（r=0.71），Ly6G6D-IL-17A相关（r=0.66），缓解期该模式消失，提示RGMa关联中性粒细胞活化而非数量，且与Th17活动态同步。

3.2 RGMa-mAb减弱PMA活化中性粒细胞驱动的Th17极化与T细胞迁移

体外transwell中PMA上调中性粒细胞NE、CD11b⁺Ly-6G/Ly-6C⁺比例，共培养后CD4⁺IL-17A⁺ T细胞增多，上清NE/CD66/IFN-γ/IL-17A升高，T细胞RORγt、IL-17A、IL-22、IFN-γ mRNA上调且迁移增强；RGMa-mAb预处理中性粒细胞即逆转上述表型，证明RGMa位于中性粒细胞分泌组上游间接调控Th17。

3.3 RGMa-mAb缓解EAE小鼠神经缺损与CNS病理

EAE组14天神经评分升高，脑与脊髓H&E示水肿及炎性浸润；RGMa-mAb组评分改善（p=0.0412），浸润评分下降，证实体内干预减轻宏观病变。

3.4 RGMa抑制减轻MOG相关凋亡损伤与中性粒细胞浸润

TUNEL-MOG共染示EAE髓鞘区凋亡信号增强，NE-MOG共染示中性粒细胞聚集；RGMa-mAb降低TUNEL⁺/MOG⁺与NE⁺/MOG⁺比值，说明RGMa阻断兼顾髓鞘保护与小胶质/中性粒细胞浸润。

3.5 RGMa关联EAE小鼠CNS内中性粒细胞-Th17炎症

ELISA示脑脊髓CD66、MPO、IFN-γ、IL-17A在EAE升高并被mAb回调；双重免疫荧光见MPO/NE⁺与RORγt/IL-17A⁺空间邻近，mAb减少重叠面积，支持“中性粒细胞–Th17”灶状共定位受RGMa调控。

3.6 RGMa相关BMP4-SMAD信号在中中性粒细胞中改变

CNS内RGMa、BMP4、MPO蛋白/mRNA于EAE升高，mAb下调；co-IP证RGMa与BMP4物理互作；Smad1/5蛋白不变，但Smad4核转位增加，mAb抑制核Smad4并降低Smad4⁺中性粒细胞占比，提示RGMa–BMP4–Smad4轴介入中性粒细胞编程。

讨论与结论翻译

讨论指出，本研究将RGMa功能从T细胞黏附（Rap1-ICAM-1）拓展至中性粒细胞-Th17模块，临床急性期相关谱、体外间接分泌组调控、体内BMP4-SMAD4核转位三者一致。局限含临床样本量小、缓解期受疾病修正治疗（DMTs）干扰、qPCR单内参、流式缺活力染料等。结论原文意译：RGMa参与CNS自身免疫中的中性粒细胞相关Th17炎症反应，可能伴随BMP4-SMAD信号改变；靶向RGMa或可成为MS神经炎症的潜在治疗策略，值得深入探究。