《Journal of Physiology and Biochemistry》：Label-free proteomic profiling identifies ECM-related alterations across regeneration states in human peripheral axonal neuropathies
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明确人外周神经再生的多机制对开发外周轴索神经病有效疗法至关重要。尽管体外与体内研究已提供重要见解，但针对人蛋白质组组成的相关研究仍较为有限。细胞外基质（ECM）在神经再生中发挥关键作用，可调控细胞黏附、增殖、迁移及最终分化。本研究采用高灵敏度无标记液相色谱-质
明确人外周神经再生的多机制对开发外周轴索神经病有效疗法至关重要。尽管体外与体内研究已提供重要见解，但针对人蛋白质组组成的相关研究仍较为有限。细胞外基质（ECM）在神经再生中发挥关键作用，可调控细胞黏附、增殖、迁移及最终分化。本研究采用高灵敏度无标记液相色谱-质谱（LC-MS）技术，分析人腓肠神经的整体蛋白质组谱，旨在表征急性轴索损伤、再生性轴索神经病及非再生性轴索神经病患者队列中的促再生或抑再生分子动态。研究共鉴定出149种蛋白质，其中68种在各组间存在显著表达差异。再生神经中高表达的蛋白质凸显了再生的多因素特征，包括免疫调节、碎片清除、细胞骨架重组、轴索延伸及脂质转运；反之，非再生神经中结构髓鞘蛋白与神经元蛋白显著下调。在差异表达蛋白质的功能富集分析中，ECM相关组分呈显著过表达，有力证实ECM并非被动支架，而是外周神经再生的主动驱动因素。
外周轴索神经病是导致患者感觉与运动功能障碍的常见疾病，其病因涵盖代谢、毒性、遗传及炎症等多种因素，但仍有大量患者病因不明，如特发性慢性轴索神经病。尽管外周神经系统具备固有再生能力，但轴索变性后的恢复常不充分，部分患者呈进行性加重且无再生证据。现有研究多聚焦于神经元与施万细胞，而ECM在构建神经再生支持微环境中的作用逐渐被关注，但人外周神经基质体的完整组成及其在再生与非再生状态下的动态变化尚未明确。本研究针对这一空白，通过人腓肠神经活检样本的蛋白质组分析，揭示ECM在神经再生中的调控机制，相关成果发表于《Journal of Physiology and Biochemistry》。
研究人员采用的关键技术方法包括：收集1994年12月至2002年4月于意大利米兰圣拉斐尔医院神经内科行腓肠神经活检的患者样本，经临床、电生理及组织学评估分为4组：对照组（3例，无神经损伤病理证据）、急性轴索损伤组（3例，急性轴索变性特征）、再生轴索组（3例，活跃轴索再生特征）、非再生轴索组（3例，严重慢性轴索神经病无再生证据）；采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行无标记LC-MS分析，通过MaxQuant软件进行蛋白质鉴定与定量，Perseus软件进行统计分析，STRING数据库进行功能富集；通过免疫荧光、蛋白质免疫印迹及施万细胞体外实验验证关键蛋白功能。
研究结果如下：
Histological grouping of human sural nerve biopsies
研究人员通过半薄切片甲苯胺蓝染色明确各组组织学特征：对照组腓肠神经髓鞘纤维数量及形态正常；急性轴索损伤组髓鞘纤维减少，可见大量轴索变性形成的卵圆体；再生轴索组可见簇状薄髓鞘纤维，为活跃再生的典型表现；非再生轴索组髓鞘纤维严重丢失，神经内膜纤维化显著。
Proteomic analysis of formalin-fixed-paraffin-embedded human sural nerves
蛋白质组分析共鉴定出149种蛋白质，其中68种表达显著调控并聚为4类。聚类1包含8种ECM蛋白，在各病理组均高表达，提示ECM在神经损伤与再生中具主动作用；聚类2包含10种蛋白，在急性轴索损伤组下调，其余组上调，功能富集显示与黏着斑及细胞骨架蛋白结合相关；聚类3包含17种蛋白，在非再生组下调，主要为髓鞘及神经元结构蛋白，反映非再生状态下结构维持机制的失效；聚类4包含最多蛋白，在急性轴索损伤组高表达，涉及急性期反应、伤口愈合、脂质转运、炎症反应、活性氧响应及细胞骨架组织等生物学过程。主成分分析（PCA）显示再生组分子谱与对照组接近，急性损伤组与非再生组各具独特分子特征。
Pairwise Proteomic Comparisons and Functional Insights
组间两两比较显示：对照组与急性轴索损伤组相比，后者ECM结构组分（如COL6A3、COL18A1、纤连蛋白FN1等）及血凝相关蛋白显著上调，细胞骨架结构组分及神经丝束组装等生物学过程下调；对照组与再生组相比，再生组ECM重塑相关蛋白上调，细胞黏附及ECM组织过程富集，对照组髓鞘及神经丝相关蛋白表达更高；对照组与非再生组相比，非再生组ECM结构组分、细胞外空间及含胶原ECM相关蛋白显著上调，神经元结构蛋白下调。STRING分析显示急性损伤组中Cofilin与纤连蛋白存在直接相互作用。
Immunofluorescence validation of human sural nerve sections
免疫荧光验证显示：对照组Cofilin及磷酸化Cofilin（p-Cofilin）表达几乎不可检测；急性轴索神经病组两者表达强烈；再生神经组呈中度表达；非再生神经组表达极低，与蛋白质组结果一致，证实Cofilin磷酸化调控在轴索生长与再生中的作用。
研究人员进一步通过施万细胞系RT4-D6P2T验证机制：纤连蛋白处理组细胞呈 elongated 梭形表型，p-Cofilin水平显著降低，总Cofilin及肌动蛋白水平无变化，表明纤连蛋白通过调控Cofilin磷酸化促进肌动蛋白细胞骨架重塑，为ECM- Cofilin-actin轴的调控关系提供功能证据。
讨论部分总结：本研究证实ECM是外周神经再生的主动调控因素，而非被动支架。急性轴索损伤后，血源性蛋白（如纤维蛋白原）浸润形成临时ECM，随后重塑为富含纤连蛋白的成熟ECM，通过调控Cofilin活性促进施万细胞迁移与轴索生长。再生神经中热休克蛋白70（Hsp72）、补体C3、载脂蛋白A1（APOA1）等蛋白表达下调，反映血-神经屏障功能恢复及微环境向促再生状态转变。非再生神经中ECM过度沉积且Cofilin活性受抑，导致再生失败。本研究受限于FFPE样本及第一代Q Exactive Orbitrap仪器的检测深度，但为后续采用数据非依赖采集（DIA）蛋白质组学拓展研究奠定了基础。
研究结论：人腓肠神经ECM在急性轴索损伤、再生性轴索神经病及非再生性轴索神经病中存在显著组成差异。急性轴索变性具有特征性ECM谱，可启动损伤修复；再生性轴索神经病中ECM为轴索再生提供支持微环境；非再生性轴索神经病中ECM组成异常导致修复机制失效。本研究明确ECM重塑是外周神经再生的核心调控环节，为靶向损伤微环境的疗法开发提供了分子基础。
