环境RNA计算性去污染的基准测试

《Frontiers in Bioinformatics》：Benchmarking computational decontamination of ambient RNA

　　

利用单细胞和单核RNA测序（sxRNA-seq）对单细胞进行基因表达谱分析，使研究人员能够以前所未有的分辨率表征细胞异质性并揭示复杂的生物过程。然而，sxRNA-seq面临环境RNA（ambient RNA）的挑战，环境RNA是并非来源于目标细胞的外来RNA分子。样本制备是环境RNA的主要来源，其中苛刻的条件可能导致细胞裂解和细胞内RNA的释放。这种不可避免的环境RNA包含可能导致错误结果并阻碍下游分析。为了解决这个问题，研究人员开发了多种方法来识别、量化和去除环境RNA。在本研究中，研究人员使用模拟数据集、不同复杂性的物种混合实验和基因型混合实验，严格评估了7种最先进的环境RNA去除方法。研究人员发现，没有一种方法在所有数据集和指标上表现最佳，但CellBender、DecontX和SoupX通常表现良好。

**论文解读：环境RNA计算性去污染方法的基准测试**

**研究背景与问题**
单细胞和单核RNA测序（sxRNA-seq）技术能够以前所未有的分辨率解析细胞异质性和复杂生物过程，但环境RNA（ambient RNA）的污染问题严重制约了其准确性。环境RNA指实验环境中非目标细胞来源的外来RNA分子，主要源自样本制备过程中的细胞裂解或膜损伤，此外还包括多路复用实验中的条形码交换、孔间交叉污染以及培养基等环境来源。这种不可避免的污染会导致虚假结果、错误细胞分类并干扰下游分析。尽管已有多种计算方法用于识别、量化和去除环境RNA，但缺乏独立、全面的基准测试来比较这些方法的性能，使得研究人员难以选择合适工具，开发者也无法明确改进方向。因此，本研究旨在系统评估7种主流环境RNA去污染方法，为实际应用和算法优化提供依据。该论文发表在《Frontiers in Bioinformatics》。

**研究内容与结论**
研究人员通过模拟数据集、不同复杂度的物种混合实验以及基因型混合实验，严格评估了CellBender、DecontX、FastCAR、scAR、scCDC、SoupX和CellClear这7种方法在去除环境RNA、保留内源性RNA以及影响下游生物学解释方面的表现。结果表明，没有一种方法在所有数据集和指标上表现最佳，但CellBender、DecontX和SoupX整体表现优异。研究还发现环境RNA普遍存在，在单核样本中平均污染率（11.80%）高于单细胞样本（7.79%），且主要来源于广泛表达的细胞质信使RNA。根据计算环境、数据可用性和先验污染期望，推荐使用CellBender、全模式DecontX或简约模式SoupX。这项研究为研究人员提供了方法选择指南，并为算法开发者指出了改进方向，具有重要的应用价值。

**关键技术方法**
研究使用了四类数据集：①模拟数据集，基于MCF12A、HCC1500和HS578T细胞系（Gambardella et al., 2022）拟合基因级负二项分布生成，具有已知污染水平；②三种物种混合数据集，包括低复杂度（人293T与小鼠3T3细胞1:1混合，来自10X Genomics）、中复杂度（人胰岛与Jurkat/32D细胞混合，GSE147203）和高复杂度（人胰岛异种移植到小鼠肾脏，GSE207393）；③基因型混合数据集，来自三种近交系小鼠品系（C57BL/6、129S1/SvImJ、CAST/EiJ）的肾脏细胞（GSE218853）；④阴性对照数据集，使用smart-seq2人胰岛数据（E-MTAB-5061）。评估指标包括环境RNA去除分数（ARS）、内源性RNA保留分数（ERS），以及下游生物学解释指标（细胞邻域纯度、标记基因选择性、批次整合质量和标签转移准确性）。

**研究结果**
**1. 环境RNA的基准测试策略**
研究人员设计了包含7种方法、多种数据集和评估指标的基准测试流程，通过模拟数据、物种混合和基因型混合实验定义真实污染谱，并纳入无污染阴性对照以评估过度校正风险。

**2. 广泛表达的mRNA对环境RNA贡献最大**
通过分析物种混合和基因型混合数据集，发现环境RNA污染水平在单核样本（平均11.80%）高于单细胞样本（平均7.79%）。细胞内污染分数变异大（四分位离散系数QCD=0.314），且与“空液滴”中基因表达水平强正相关（平均R=0.857），前10%最频繁表达的基因贡献了82.30%的环境RNA。细胞质量参数（如UMI数、外显子比例）与污染分数关联弱，表明环境RNA是随机采样过程，无法通过严格质控完全消除。

**3. 环境RNA去除与内源性RNA保留的平衡**
scAR（平均ARS=0.679）和CellBender（平均ARS=0.604）在环境RNA去除上表现最佳，但scAR显著去除内源性RNA（平均ERS=0.445），尤其对低表达基因影响大。DecontX和SoupX在去除和保留间取得较好平衡，而FastCAR和scCDC主要去除高表达基因的环境RNA，CellClear去除低表达基因环境RNA但内源性RNA损失严重。在无污染对照数据集中，所有方法均导致内源性RNA信号损失。

**4. 去污染对生物学解释的影响**
在合成数据集中，仅CellBender改善了无监督聚类对真实细胞类型的分离能力，DecontX和scAR提高了标记基因模块评分，但scAR在无污染数据集中引入显著负面效应。在细胞邻域质量方面，CellBender、scAR、SoupX和DecontX改善了污染数据集的邻域纯度，对阴性对照影响小。在标记基因选择性上，scAR和CellBender提高了熵、Moran's I和基尼系数。批次整合方面，多数方法未显著改善，scAR反而降低整合质量。标签转移方面，scAR、CellBender、DecontX和CellClear改善了标签转移准确性，但scAR在无污染数据集中表现不佳。

**讨论与结论**
讨论指出环境RNA普遍存在，81.56%的细胞/核含有一定污染水平，且污染水平与常用细胞质量参数弱相关。不同方法存在表达水平偏倚：scCDC和FastCAR主要去除高表达基因，CellClear主要去除低表达基因，DecontX和SoupX偏倚较小。环境RNA去除与下游生物学性能并非简单线性关系，最优校正水平取决于下游应用。结论部分翻译如下：总之，研究人员建议使用CellBender、全模式DecontX或简约模式SoupX，这三种方法在环境RNA去除与正向影响下游分析之间取得了最佳整体权衡。选择应基于预期性能、污染先验期望、可用性和可扩展性。CellBender和全模式DecontX在无污染时更易过度校正，而简约模式SoupX适用于仅提供过滤计数矩阵的数据集。此外，本基准测试开放源代码，支持持续更新，并指出构建更好去污染方法的关键限制在于缺乏合适的数据集。未来需要新的实验设计，使内源性和环境RNA共享相同特征空间，同时能无偏准确地测量污染。