《Frontiers in Neuroscience》：Novel insights into β3-adrenoceptor function in a model of retinopathy of prematurity: the contribution of astrocytes to retinal protection
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β-肾上腺素能受体（β-AR）系统与视网膜的病理性血管生成有关。在三种β-AR中，β3-AR的作用仍有待阐明。在氧诱导视网膜病变（OIR）的小鼠模型中，研究人员使用129S近交系小鼠品系研究了β3-AR的作用，该品系因其促血管生成因子与抗血管生成因子之间的显著
β-肾上腺素能受体（β-AR）系统与视网膜的病理性血管生成有关。在三种β-AR中，β3-AR的作用仍有待阐明。在氧诱导视网膜病变（OIR）的小鼠模型中，研究人员使用129S近交系小鼠品系研究了β3-AR的作用，该品系因其促血管生成因子与抗血管生成因子之间的显著失衡而对缺氧高度敏感。研究人员发现，使用BRL37344和CL316243（均为强效的第一代β3-AR激动剂）激活β3-AR，可促进中央视网膜的再血管化，同时伴随星形胶质细胞模板的恢复。中央视网膜血管化的恢复可防止缺氧的发生，从而阻止促血管生成通路的激活，并抑制中周边区域的新生血管过度生长、血视网膜屏障渗漏和视网膜功能障碍。研究人员发现，血管拯救和星形胶质细胞密度的恢复与针对OIR相关视网膜神经节细胞（RGC）丢失的保护作用相关，RGC功能活动的恢复也证明了这一点。RGC的拯救与神经营养因子可用性的恢复相关联，而这些神经营养因子在缺氧条件下会受到损害。来自显微解剖星形胶质细胞的结果表明，星形胶质细胞可能对视网膜拯救有贡献。β3-AR已成为缺氧依赖性新生血管形成的潜在中介，从而为探索星形胶质细胞恢复与视网膜拯救之间的因果关系提供了理论基础，旨在强调β3-AR激动剂在增殖性视网膜病变中的治疗潜力。
**论文解读：β3-肾上腺素能受体在早产儿视网膜病变模型中的新功能——星形胶质细胞对视网膜保护的贡献**
**研究背景与问题**
早产儿视网膜病变（ROP）是导致儿童视力严重受损的主要原因之一，其病理特征为缺血性损伤引发的视网膜病理性新生血管过度生长。氧诱导视网膜病变（OIR）模型可模拟ROP，并扩展至其他以新生血管过度生长为特征的广泛视网膜病变。OIR模型包含两个连续阶段：第一阶段是高氧期，导致中央视网膜血管丢失，引发低氧张力；第二阶段是低氧期，通过激活促血管生成级联反应，导致中周边区域出现紊乱的新生血管再生长，并伴随血视网膜屏障（BRB）破坏和视网膜功能障碍。此外，中央无血管区因缺血环境导致视网膜神经节细胞（RGC）丢失。缺氧不仅直接激活转录因子缺氧诱导因子1（HIF-1）上调血管内皮生长因子（VEGF），还过度激活交感神经系统，增加去甲肾上腺素（NE）释放，进而激活视网膜中的β-肾上腺素能受体（β-AR）。其中，β3-AR因其独特的药理学特性（如缺乏磷酸化位点、选择性偶联cAMP和NO/cGMP通路、对儿茶酚胺低敏感性）而成为药物研发的潜在靶点。既往研究表明，β3-AR在缺氧条件下上调，且是HIF-1的新靶基因，提示其可能作为氧水平与视网膜血管增殖之间的中介。然而，在常见的C57BL/6J（C57）品系OIR模型中，β3-AR药理学对新生血管无明显影响。因此，本研究旨在利用对缺氧高度敏感的129S3/SvIM（129S）品系，首次评估β3-AR在缺氧驱动视网膜血管增殖中的潜在调控作用，并探讨星形胶质细胞是否参与β3-AR介导的视网膜保护。
**研究内容与结论**
研究人员在129S品系小鼠的OIR模型中，评估了β3-AR激动剂（BRL37344和CL316243）对缺氧相关视网膜损伤（包括新生血管增殖、BRB功能障碍、星形胶质细胞损伤和RGC丢失）的疗效，并通过视网膜电图（ERG）记录检测视网膜功能变化。此外，通过显微解剖星形胶质细胞，进一步探究β3-AR激活对星形胶质细胞功能的直接影响。结果发现：β3-AR激动剂促进中央视网膜再血管化，恢复星形胶质细胞模板，从而防止缺氧诱导的促血管生成通路激活，抑制中周边新生血管过度生长，并恢复BRB完整性和视网膜功能。同时，β3-AR激活保护了RGC，恢复了神经营养因子（如脑源性神经营养因子BDNF）水平。在显微解剖的星形胶质细胞中，β3-AR激动剂直接下调了缺氧诱导的促血管生成因子、细胞外基质（ECM）成分和神经营养因子相关基因表达，表明星形胶质细胞是β3-AR保护作用的关键效应细胞。该研究发表在《Frontiers in Neuroscience》上，揭示了β3-AR作为缺氧依赖性新生血管形成中介的新角色，为增殖性视网膜病变的治疗提供了新靶点。
**主要关键技术方法**
本研究使用了129S3/SvIM（129S）近交系小鼠品系（购自Charles River Laboratories, Italia），并辅以C57BL/6J（C57）品系和FVB/N背景β3-AR敲除（β3-AR
–/–）小鼠（购自Jackson Laboratory）。主要技术包括：氧诱导视网膜病变（OIR）模型建立（从出生后第7天至第12天暴露于75%氧气，第12天至第17天恢复常氧）；皮下注射β3-AR激动剂（BRL37344和CL316243）及拮抗剂（SR59230A）；视网膜全mount的异凝集素B4（IB4）染色量化血管区域；Western blot检测蛋白表达（HIF-1α、VEGF、PEDF、ZO-1、claudin-5、GFAP、PAX2、CNTF、BDNF等）；免疫荧光染色（GFAP、PAX2、RBPMS、β-III-tubulin、β3-AR）结合共聚焦显微镜；酶辅助显微解剖法分离视网膜星形胶质细胞；定量实时RT-PCR检测mRNA表达；Evans蓝染料评估BRB渗漏；暗适应全视野ERG和模式ERG（PERG）记录视网膜功能。
**研究结果**
**3.1 β3-AR激动剂阻止缺氧新生血管反应**
通过IB4染色发现，129S品系小鼠在OIR后血管簇面积比C57品系高约160%，且β3-AR蛋白水平升高约350%。BRL37344或CL316243处理使中央无血管区面积减少约92%和89%，新生血管簇面积减少约96%和91%，该效应被β3-AR拮抗剂SR59230A消除。BRL37344还降低了HIF-1α和VEGF水平，升高了抗血管生成因子PEDF水平，并抑制了HIF-1α对β3-AR的转录激活。
**3.2 β3-AR激动剂阻止BRB渗漏并恢复视网膜功能**
BRL37344恢复了OIR诱导的Evans蓝染料外渗，并上调了紧密连接蛋白ZO-1和claudin-5至接近正常水平。暗适应ERG显示，BRL37344显著提高了a波和b波振幅，但仍低于正常对照；PERG记录表明BRL37344恢复了RGC功能，N1-P1和P1-N2振幅升高。
**3.3 β3-AR激动剂恢复星形胶质细胞模板**
GFAP免疫荧光显示，BRL37344恢复了中央视网膜的星形胶质细胞形态，减少了Müller细胞胶质化；在中周边区域，BRL37344防止了星形胶质细胞和血管的异常排列。PAX2免疫染色定量分析表明，OIR导致中央视网膜星形胶质细胞密度降低约33%，中周边增加约100%；BRL37344使中央和中周边PAX2阳性细胞数均超过对照约50%，Western blot显示PAX2蛋白水平升高约220%。
**3.4 β3-AR激动剂促进中央视网膜RGC拯救**
RBPMS免疫染色显示，BRL37344使RGC密度增加约25%（从下降约50%恢复）。PERG记录中，N1-P1和P1-N2振幅分别增加约70%和100%，但仍低于正常。β-III-tubulin和GFAP共染显示，BRL37344恢复了RGC轴突和星形胶质细胞分布。Western blot显示，BRL37344将升高的CNTF水平降低约50%，将降低的BDNF水平增加约3倍。
**3.5 β3-AR与显微解剖星形胶质细胞中恢复的星形胶质细胞的偶联**
在显微解剖的星形胶质细胞中，β3-AR与GFAP共定位，OIR后GFAP和β3-AR荧光强度分别增加约340%和570%，BRL37344使其降低约66%和65%。mRNA水平证实了类似变化。BRL37344降低了促血管生成因子VEGF和FGF2的mRNA（分别降低约60%和46%），以及ECM成分（纤连蛋白1、层粘连蛋白α1、层粘连蛋白γ1）和整合素（αV、β1、β8）的mRNA。同时，BRL37344将CNTF mRNA降低约30%，将BDNF mRNA升高约75%。
**讨论与结论**
讨论部分强调，β3-AR激活通过促进中央视网膜再血管化并恢复星形胶质细胞模板，从而阻止缺氧驱动的中周边新生血管形成。星形胶质细胞的恢复与RGC轴突支持和神经营养因子供应相关，其中BDNF水平恢复对RGC存活至关重要。β3-AR在星形胶质细胞上的直接作用可能调控其缺氧反应性、促血管生成信号、ECM重塑和神经营养支持，从而将反应性星形胶质细胞重编程为更稳态和神经保护的表型。研究还指出了局限性，包括129S品系高表达β3-AR可能放大了治疗效果，以及第一代激动剂（BRL37344和CL316243）对啮齿类β3-AR的选择性优于人类，且SR59230A拮抗剂也存在药理学局限性。尽管如此，β3-AR激动剂已在临床上用于治疗膀胱过度活动症且眼部耐受性良好，一项非随机试验正在评估其对年龄相关性黄斑变性（AMD）患者的疗效。结论部分翻译如下：β3-AR激动剂作用于OIR的血管闭塞阶段特别有吸引力，因为血管闭塞的严重程度在很大程度上影响后续的新生血管过程，表明β3-AR可能是ROP治疗的一个新颖且有前景的靶点。另一方面，促进中央视网膜再血管化的干预措施并不预期成比例地影响新生血管过程，而减少新生血管增殖并不一定促进血管生理性再生长入无血管区。另一方面，将观察到的效应具体归因于β3-AR激活需要更大的谨慎，特别是在缺乏旨在强调β3-AR激活与RGC恢复之间因果关系的实验设计的情况下。此外，β3-AR相关的无血管区恢复伴随着星形胶质细胞模板的改善，并且星形胶质细胞对缺氧的反应直接受β3-AR激活影响，这表明β3-AR激动剂通过恢复星形胶质细胞管理的修复机制来保护缺氧视网膜。尽管β3-AR激动剂的使用可能因它们已在市场上用于治疗膀胱过度活动症患者且在眼部耐受性良好而得到促进，并且一项非随机试验正在进行以确定β3-AR激动剂在患有膀胱过度活动症和并发年龄相关性黄斑变性（AMD）的患者中是否能安全有效地减少眼睛从干性AMD向湿性AMD的转化，但仍需要进一步的研究来确定β3-AR激动剂与视网膜从缺氧损伤中拯救之间的因果关系。
