全基因组CRISPR筛选鉴定RNF24为口蹄疫病毒进入的关键宿主因子

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Genome-wide CRISPR screen identifies RNF24 as a critical host factor for foot-and-mouth disease virus entry

　　

背景：口蹄疫病毒（FMDV）在全球畜牧业中造成巨大的经济损失；然而，支持其早期感染过程的关键宿主因子仍未被充分阐明。方法：在本研究中，研究人员利用猪细胞进行了一项无偏倚的全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选，以筛选并鉴定参与FMDV感染的宿主因子。结果：研究人员鉴定出E3泛素连接酶RNF24支持高效的FMDV进入。RNF24缺失抑制病毒进入和复制，而其过表达增强病毒感染性。机制上，RNF24优先促进leupaxin（LPXN）在第162位赖氨酸（Lys¹⁶²）处的K²⁷连接（K27-linked）非降解性多聚泛素化，驱动LPXN向质膜转运。在膜上，LPXN组装成一个三元整合素-LPXN-VP1复合物，加强病毒-受体相互作用，促进病毒吸附和进入。通过LPXN K162R突变破坏该泛素化事件会损害复合物形成并削弱病毒进入。结论：总之，本研究揭示了一个支持FMDV进入的泛素依赖性RNF24-LPXN调控轴，强调了非降解性泛素化在病毒发病机制中的作用，并提出了这一界面作为抗病毒干预的潜在靶点。

口蹄疫病毒（FMDV）属于小RNA病毒科（Picornaviridae）口疮病毒属，是一种高度传染性病原体，主要感染牛、猪、羊等偶蹄动物，导致口腔、蹄部和乳腺出现水疱性病变，造成严重发病率和生产力下降，幼龄动物死亡率升高，每年给全球畜牧业造成数十亿美元的经济损失，对粮食安全和动物国际贸易构成持续威胁。尽管病毒与整合素等受体的直接相互作用已有结构基础解析，但宿主调控因子如何协调病毒-受体复合物在质膜上的组装并调节病毒内化效率，仍知之甚少，这成为全面理解FMDV致病机制的重要障碍。为系统鉴定这些关键宿主因子，研究人员利用CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选技术，在猪LLC-PK1细胞中开展无偏倚筛选，发现E3泛素连接酶（催化泛素化修饰的酶）RNF24是FMDV进入的关键宿主因子。进一步机制研究表明，RNF24通过促进leupaxin（LPXN）在K162位点的K²⁷连接非降解性多聚泛素化，驱动LPXN向质膜转运，进而组装整合素-LPXN-VP1三元复合物，稳定病毒-受体相互作用，增强病毒吸附和内化。该研究首次揭示了RNF24的E3连接酶功能及其在病毒进入中的非降解性泛素化调控机制，提出了RNF24-LPXN调控轴作为抗病毒干预的潜在靶点，扩展了对整合素介导病毒进入的理解，为防控FMDV提供了新思路。论文发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。

关键技术方法概括：研究人员采用猪全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选（PigGeCKO v2.0文库，覆盖21,139个猪蛋白编码基因，含82,371条sgRNA及1,000条非靶向对照sgRNA），在LLC-PK1猪肾上皮细胞中构建突变细胞库，随后进行三轮渐增感染复数（MOI）的FMDV挑战（第一轮0.00001，第二轮0.001，第三轮0.01），存活细胞经测序鉴定富集sgRNA。关键验证方法包括：CRISPR/Cas9单克隆敲除细胞系构建、shRNA敲低、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光共定位、细胞分级分离、Western blot、qPCR、病毒结合与内化实验、噬斑实验。FMDV O/HN/CHA/93株由国家口蹄疫参考实验室提供。

研究结果：
1. 全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选鉴定RNF24为FMDV感染必需宿主因子：通过三轮筛选，23个宿主基因持续富集；对其中17个候选基因构建混合突变细胞系，发现其突变均显著抑制FMDV复制；进一步聚焦RNF24，构建RNF24纯合敲除（RNF24-KO）细胞系，证实敲除后显著抑制病毒蛋白表达和病毒滴度，而过表达RNF24则增强感染，且FMDV感染可上调RNF24蛋白水平。
2. RNF24敲除破坏FMDV复制早期阶段：qPCR显示RNF24-KO细胞在感染后2小时病毒RNA水平即显著降低；病毒结合与内化实验表明RNF24敲除显著降低病毒吸附和内化效率，免疫荧光检测双链RNA（dsRNA，病毒复制中间体）显示RNF24-KO细胞中dsRNA水平降低；病毒释放实验未发现明显差异，说明RNF24主要影响病毒进入和早期复制，不参与释放。
3. RNF24通过调节整合素介导通路促进FMDV进入：RNF24敲除降低整合素αv（ITGAV）和β1（ITGB1）的mRNA和蛋白水平，而过表达不改变其表达；Co-IP和免疫荧光证实RNF24与ITGAV和ITGB1相互作用且共定位，但不与病毒VP1蛋白直接结合；RNF24过表达增强VP1与ITGAV/ITGB1的结合。
4. RNF24与LPXN相互作用：UbiBrowser 2.0预测LPXN为RNF24的泛素化底物；Co-IP和免疫荧光证实RNF24与LPXN相互作用且共定位；RNF24敲除降低LPXN蛋白水平，而过表达不改变其表达；放线菌酮（CHX）追踪实验表明RNF24不影响LPXN蛋白稳定性。
5. RNF24促进LPXN在K162位点的K²⁷连接泛素化：LPXN可被泛素化且不导致降解；RNF24过表达增强LPXN泛素化，敲除则减弱；RNF24的RING结构域突变体（C78A/C81A/H98A/H101A）丧失促进LPXN泛素化及增强FMDV复制的能力；利用赖氨酸突变体筛选，发现RNF24优先促进K²⁷连接泛素化，且K27R完全消除该效应；通过截短和点突变，确定K162为关键位点；细胞分级分离和免疫荧光显示RNF24促进LPXN向质膜转位，而K162R突变体呈弥散胞质分布。
6. LPXN在FMDV进入中起关键作用：LPXN过表达增强FMDV VP1蛋白水平和病毒滴度，shRNA敲低则抑制；结合与内化实验显示LPXN敲低降低病毒吸附和内化；免疫荧光显示LPXN与VP1在感染早期共定位；FMDV感染上调LPXN蛋白水平；在LPXN敲低细胞中，回补野生型LPXN可恢复FMDV感染，而K162R突变体无法恢复，且K162R突变体不能挽救病毒吸附和内化缺陷。
7. RNF24促进整合素-LPXN-VP1三元复合物组装：Co-IP证实LPXN与VP1、ITGAV、ITGB1均相互作用，且形成三元复合物；免疫荧光显示三者共定位于质膜；VP1截短实验表明LPXN与全长及N端和C端片段均结合，而ITGAV仅结合全长VP1，ITGB1结合全长及N端片段；LPXN敲低减弱VP1与ITGAV/ITGB1的相互作用，而LPXN回补可部分恢复；与野生型LPXN不同，K162R突变体不能有效促进VP1与整合素的结合。

讨论部分总结：本研究通过猪全基因组CRISPR筛选首次发现RNF24是FMDV感染的关键宿主因子，其机制不同于先前报道的CRISPR筛选（如TOB1），且未发现重叠候选基因，突出了不同筛选条件可鉴定不同宿主因子。RNF24定位于高尔基体，此前无E3连接酶活性报道，本研究首次证明其通过K²⁷连接非降解性泛素化促进LPXN膜转位，从而组装整合素-LPXN-VP1三元复合物，稳定病毒-受体结合并促进进入。LPXN作为paxillin家族成员，新发现其参与病毒进入，补充了整合素介导FMDV进入的调控网络。研究局限在于主要基于猪细胞系，是否在牛、羊等天然宿主细胞及体内发挥作用尚待验证。RNF24敲除降低整合素表达，而过表达无此效应，提示其促病毒作用主要通过LPXN泛素化介导的膜支架功能。与多数RNF家族蛋白通过降解或免疫信号发挥抗病毒作用不同，RNF24以非降解性泛素化机制促进病毒进入，代表了RNF家族在病毒-宿主互作中的新作用模式。结论翻译：总之，本研究描绘了一个调控轴，RNF24通过促进LPXN在K162残基处的K²⁷连接泛素化，从而促进整合素-LPXN-VP1复合物的组装，进而促进FMDV进入。研究结果确定了RNF24和LPXN是FMDV感染的关键宿主调节因子，扩展了当前对整合素介导病毒进入的理解，并提供了对FMDV-宿主相互作用网络的更深入见解。这项工作突出了针对FMDV的潜在抗病毒靶点，为优化预防策略提供了理论指导，并为开发宿主导向的抗病毒方法奠定了基础。