《Frontiers in Neuroscience》：Morphine-induced μ-opioid receptor isoform MOR-1X amplifies dependence-related signaling
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临床使用的阿片类药物，例如吗啡，主要通过μ-阿片受体（MOR）发挥作用，该受体由OPRM1基因编码，且该基因经历广泛的选择性剪接。目前已鉴定出超过20种OPRM1异构体，但功能表征主要集中于经典的MOR-1变体。随着三维人脑类器官（hCOs）的出现，研究人员现
临床使用的阿片类药物，例如吗啡，主要通过μ-阿片受体（MOR）发挥作用，该受体由OPRM1基因编码，且该基因经历广泛的选择性剪接。目前已鉴定出超过20种OPRM1异构体，但功能表征主要集中于经典的MOR-1变体。随着三维人脑类器官（hCOs）的出现，研究人员现在能够更准确地模拟人类特异性神经元对阿片类药物的反应。在本研究中，研究人员建立了hCOs作为功能平台，以探究吗啡对OPRM1前体mRNA剪接和阿片信号的影响。研究人员生成了iPSC衍生的hCOs和神经元，随后对其进行或不进行吗啡处理，并通过细胞和分子/生化分析进行筛选。研究人员的RT-PCR和RT-qPCR结果显示，吗啡暴露以剂量依赖性方式选择性地诱导hCOs和iPSC衍生神经元中的MOR-1X异构体。研究人员利用CRE/CREB过表达质粒和慢病毒构建体测量吗啡对环磷酸腺苷（cAMP）信号的影响。在吗啡戒断后，与MOR-1相比，表达MOR-1X的细胞表现出显著增强的cAMP超激活，这是阿片依赖的分子标志。此外，通过短发夹RNA（shRNA）对MOR-1X进行异构体特异性敲低，有效消除了iPSC衍生神经元中的这种cAMP超射。总之，这些发现将MOR-1X确定为一个吗啡诱导的异构体，在阿片信号、适应和依赖的分子机制中具有潜在的关键作用。
**论文解读文章：吗啡诱导的μ-阿片受体异构体MOR-1X在依赖相关信号中的作用**
**1. 研究背景与问题提出**
阿片类药物的滥用已成为全球性公共卫生问题，其中μ-阿片受体（MOR）是临床和非法阿片类药物（如吗啡）的主要作用靶点。MOR由人类OPRM1基因编码，该基因通过广泛的选择性剪接产生超过20种异构体，包括全长7次跨膜（7TM）异构体、截短的6TM和1TM异构体。尽管已有大量研究聚焦于经典MOR-1异构体，但其他异构体（尤其是人类特有的MOR-1X）的功能及其在阿片信号传导、适应和依赖中的作用仍知之甚少。MOR-1X包含独特的外显子X，其C端结构域显著长于MOR-1，并含有额外磷酸化位点。既往研究在神经母细胞瘤细胞系中发现吗啡优先诱导MOR-1X表达，且死后脑组织样本中海洛因使用者MOR-1X表达上调，提示该异构体可能由外源性阿片类药物诱导并具有独特功能。然而，MOR-1X与MOR-1在阿片信号、适应和依赖中的差异尚不清楚。由于MOR-1X是人类特异性异构体，需要合适的体外模型进行研究。近年来，诱导多能干细胞（iPSC）来源的三维人脑类器官（hCOs）的出现，为模拟人类特异性脑发育和疾病提供了新平台。hCOs能重现大脑的神经元类型和区域组织，并已展示出可模拟阿片暴露后体内效应，包括神经元成熟改变、突触信号和应激通路激活。因此，本研究旨在建立hCOs作为功能性平台，探究吗啡对OPRM1选择性剪接的影响，并重点解析MOR-1X异构体在阿片依赖相关信号中的角色。该研究发表在《Frontiers in Neuroscience》。
**2. 主要关键技术方法**
研究人员采用未引导分化方案从iPSCs生成hCOs，并利用STEMdiff? SMADi Neural Induction Kit分化iPSCs为神经前体细胞（NPCs），进一步分化为前脑和中脑神经元。吗啡处理浓度范围为0.5–5 μM，处理时间6–36小时。主要技术包括：半定量RT-PCR和一步法RT-qPCR检测OPRM1异构体表达；BaseScope?原位杂交可视化MOR和MOR-1X mRNA；CRE/CREB荧光素酶报告基因慢病毒系统检测cAMP信号；构建MOR-1或MOR-1X表达质粒转染HEK293细胞，以及MOR-1X特异性shRNA慢病毒敲低iPSC神经元中的MOR-1X；此外，利用IPA分析61个阿片转录反应相关基因的表达变化。样本来源于实验室已有的iPSC系。
**3. 研究结果**
**3.1 人脑类器官（hCOs）重现阿片诱导的cAMP信号和戒断反应**
通过CRE荧光素酶报告基因检测，急性吗啡处理（5 μM，4小时）导致hCOs中cAMP水平显著降低；而慢性吗啡处理（36小时）后经PBS洗脱诱导戒断，cAMP水平显著升高，即cAMP超射现象，表明hCOs能有效模拟阿片依赖的细胞适应。
**3.2 吗啡调节hCOs中的阿片反应基因网络**
对61个与阿片转录反应相关基因进行RT-qPCR和IPA分析，发现吗啡处理激活cAMP介导的信号、CREB信号、GABA受体信号、GPCR信号和Gαi信号等经典阿片通路，而纳洛酮可逆转这些激活，证实吗啡的特异性作用。
**3.3 吗啡诱导hCOs中OPRM1的选择性剪接并上调MOR-1X异构体**
半定量RT-PCR显示，吗啡处理6小时不影响MOR-1及其他10种7TM异构体，但显著诱导MOR-1X。RT-qPCR进一步证实MOR-1X表达呈剂量依赖性增加（1 μM和5 μM），而MOR-1不变。BaseScope原位杂交显示，吗啡处理组MOR-1X阳性信号显著增多，总MOR表达无变化。
**3.4 吗啡在iPSC来源的前脑和中脑神经元中剂量依赖性上调MOR-1X**
在iPSC分化的成熟前脑和中脑神经元中，吗啡处理6小时以1 μM和5 μM浓度显著诱导MOR-1X表达，MOR-1水平无变化，且该效应与神经元区域类型无关。
**3.5 MOR-1X异构体驱动cAMP超射和吗啡依赖**
在HEK293细胞中过表达MOR-1或MOR-1X，急性吗啡处理均抑制cAMP，但戒断时MOR-1X组cAMP超射幅度显著高于MOR-1组。在iPSC前脑神经元中，利用MOR-1X特异性shRNA敲低该异构体后，急性吗啡抑制cAMP的能力不受影响，但戒断诱导的cAMP超射被显著消除，表明MOR-1X是吗啡依赖相关cAMP信号所必需的。
**4. 讨论与结论**
讨论部分指出，hCOs可作为研究阿片信号的功能模型，但缺乏外周免疫和血管成分，需要进一步改进。MOR-1X具有更长的C端和额外磷酸化位点，可能导致不同的下游信号。研究结果证实，MOR-1X在急性抑制腺苷酸环化酶（AC）方面与MOR-1相似，但戒断时引起显著更高的cAMP超射，且敲低MOR-1X可防止这种超射，提示MOR-1X在吗啡依赖相关信号中发挥关键作用。研究结论翻译如下：总之，这些数据表征了hCOs中的经典吗啡信号，并建立了这些hCOs中急性和慢性/戒断信号的功能读数。这为使用hCOs进一步理解在人类大脑体外模型中阿片依赖的分子信号打开了大门。此外，研究人员的结果表明，可诱导的OPRM1异构体MOR-1X的功能不同于经典研究的异构体，它可能通过影响cAMP通路在阿片依赖信号的发展中起关键作用。对MOR-1X特异性信号的进一步探索可能有助于识别依赖相关信号中涉及的新靶点和通路，从而提供新的治疗选择。
