脂溶性β-半乳糖苷酶响应性近红外探针用于细胞衰老体内成像的合理设计

《Smart Molecules》：Rational design of a lipophilic β-galactosidase-responsive near-infrared probe for in vivo imaging of cellular senescence

　　

衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是细胞衰老的关键生物标志物，已被证明是多种年龄相关疾病和肿瘤耐药的主要驱动因素。然而，由于现有探针的膜通透性差、依赖瘤内注射以及血脑屏障（BBB）通透性有限，SA-β-gal的非侵入性体内成像仍具有挑战性。本研究报道了一种新型合理设计的近红外（NIR）荧光探针DCIP-AcGal，该探针通过利用具有BBB穿透能力的荧光团与乙酰化β-半乳糖结合，采用协同脂溶性导向设计策略。其SA-β-gal敏感的NIR发射特性使研究人员能够对衰老细胞进行深部组织成像，具有低背景和高信噪比。该探针的良好脂溶性促进其通过细胞膜的被动扩散，确保在溶酶体内被SA-β-gal有效激活。其成像衰老细胞的特异性已通过GLB1敲低实验验证，其荧光强度和分布与p21表达呈正相关。静脉注射后，DCIP-AcGal能够对活体小鼠中palbociclib诱导的肿瘤衰老进行非侵入性成像。此外，由于其良好的脂溶性，该探针能够穿过BBB，从而评估老年小鼠大脑中的衰老积累。这些发现表明，探针DCIP-AcGal为研究衰老生物学和监测衰老治疗干预的疗效提供了有价值的工具。

细胞衰老（cellular senescence）是一个由端粒功能障碍、DNA损伤、癌基因激活和氧化应激等应激触发的复杂生物学过程，其特征是细胞增殖的稳定且不可逆的停滞。衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是衰老细胞溶酶体中高度富集的GLB1编码水解酶，已成为细胞衰老检测中最广泛接受的生物标志物。然而，现有β-半乳糖苷酶激活型荧光探针存在关键局限性：传统探针直接连接多羟基化β-半乳糖识别基团，导致亲水性过强、膜通透性差，体内分布效率及成像信噪比严重受损；多数探针发射波长短，易受自发荧光干扰且组织穿透深度有限；现有探针多依赖瘤内注射等局部给药方式，无法实现非侵入性全身检测；更重要的是，在探针设计中极少考虑血脑屏障（BBB）穿透能力，而中枢神经系统中衰老细胞的异常积累是阿尔茨海默病、帕金森病等年龄相关神经退行性疾病的关键病理驱动因素。为克服这些挑战，研究人员开发了一种新型合理设计的近红外（NIR）荧光探针DCIP-AcGal，采用协同脂溶性导向设计策略，首次利用乙酰化β-半乳糖作为SA-β-gal识别基团，并将其嫁接到具有BBB穿透能力的荧光团上。该探针具备SA-β-gal敏感的NIR发射特性，能够对衰老细胞进行深部组织成像，背景低、信噪比高。静脉注射后，DCIP-AcGal在化疗诱导的肿瘤衰老模型和自然衰老小鼠脑组织中均表现出优异的成像性能，且具有良好的生物相容性。该NIR探针为研究系统性衰老生物学和神经退行性疾病的早期诊断提供了有力工具，同时也为体内衰老治疗干预的实时监测开辟了新途径。论文发表在《Smart Molecules》。

研究人员开展研究涉及的主要关键技术方法包括：采用五步合成路线制备探针DCIP-AcGal，通过Knoevenagel缩合、亲核取代及点击化学引入氟乙基叠氮基团以提供未来¹⁸F放射性标记潜力；利用吸收光谱、荧光光谱及高效液相色谱（HPLC）评估探针对β-半乳糖苷酶（β-gal）的响应性能，包括线性关系、检测限、动力学及pH稳定性；通过竞争抑制实验、高分辨质谱（HRMS）和分子轨道计算验证传感机制，并采用分子动力学（MD）模拟预测磷脂膜亲和力及BBB穿透性；在细胞层面，使用MDA-MB-231、HCT116、HT22和IMR-90细胞系建立肿瘤细胞和正常细胞衰老模型（分别通过阿霉素、博来霉素诱导及复制性衰老），通过GLB1敲低（siRNA）验证特异性，并结合溶酶体示踪剂和p21免疫荧光进行共定位分析；在动物层面，建立MDA-MB-231异种移植瘤裸鼠模型，通过palbociclib口服给药诱导肿瘤衰老，静脉注射探针后进行体内荧光成像及离体组织分析；同时，使用3月龄和21月龄自然衰老小鼠，静脉注射后离体成像评估脑组织衰老，并辅以血清生化及苏木精-伊红（H&E）染色评估生物安全性。

**2.1 探针DCIP-AcGal的合理设计与合成**
通过协同脂溶性导向设计，以基于二氰基异佛尔酮（DCI）骨架的荧光团作为信号单元，引入乙酰化β-半乳糖作为SA-β-gal特异性触发基团，乙酰化降低了糖基亲水性，确保整体脂溶性以促进被动扩散。探针通过五步合成路线获得，包括Knoevenagel缩合、亲核取代、炔基引入及铜催化的叠氮-炔环加成反应，所有中间体经核磁共振和质谱表征。

**2.2 对β-半乳糖苷酶活性的光谱响应**
在磷酸盐缓冲液（含30%二甲基亚砜，pH 7.4）中，DCIP-AcGal在540 nm处吸收微弱，657 nm处荧光发射弱。与β-gal孵育后，吸收和荧光强度呈剂量依赖性增强，荧光强度在0–2 U/mL范围内与β-gal浓度呈良好线性关系（y=334.90x+26.28，R2=0.9877），检测限为0.059 U/L。动力学显示45–60 min内达到平台，光稳定性好（1 h连续照射后衰减率<8%），在pH 6.0–8.0范围内荧光稳定。选择性实验表明，多种离子、氨基酸、酶及生物活性分子均未引起明显荧光增强，也不干扰β-gal激活。

**2.3 探针DCIP-AcGal的传感机制**
竞争抑制实验显示D-半乳糖（1 mM）可抑制79%的荧光增强，证明β-gal活性是关键。HPLC和HRMS分析表明，β-gal水解DCIP-AcGal的糖苷键，释放出荧光团DCIP-OH（m/z 432.1848）。分子轨道分析显示，DCIP-OH的最高占据分子轨道-最低未占分子轨道（HOMO-LUMO）能隙（2.35 eV）小于DCIP-AcGal（2.80 eV），恢复了分子内电荷转移（ICT）过程，导致吸收和发射光谱红移。分子动力学模拟表明，DCIP-AcGal在200 ns内快速锚定并嵌入磷脂双分子层，而未乙酰化的DCIP-Gal则无法稳定结合。三个在线平台（ADMETlab3.0、DeepPK、DrugFlow）预测均显示乙酰化提高了探针的BBB通透性。

**2.4 作为衰老探针的特异性激活与亚细胞定位**
在阿霉素诱导的MDA-MB-231和HCT116肿瘤细胞衰老模型，以及博来霉素处理的HT22细胞和复制性衰老的IMR-90细胞中，DCIP-AcGal展现出强红色荧光信号，而对照细胞荧光微弱。GLB1敲低后，衰老HCT116细胞的β-gal蛋白表达和X-gal染色减弱，同时DCIP-AcGal荧光信号显著降低，证实其激活依赖于β-gal。共定位实验显示，DCIP-AcGal荧光与溶酶体示踪剂Lyso-Tracker高度重叠（Pearson相关系数分别为0.85和0.65），表明信号主要来源于溶酶体。荧光强度与p21核表达呈正相关，进一步验证了其与衰老标志物的关联。

**2.5 使用DCIP-AcGal进行肿瘤衰老的体内成像**
在MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型中，palbociclib（CDK4/6抑制剂）口服给药诱导肿瘤衰老，X-gal和Ki67染色证实肿瘤内β-gal活性升高、增殖细胞减少。静脉注射DCIP-AcGal后，palbociclib组肿瘤区域在30 min达到峰值荧光，并持续至1 h，显著高于对照组。离体荧光成像显示，处理组肿瘤荧光强度是对照组的2倍以上，而其他器官无显著差异。肿瘤冰冻切片进一步证实DCIP-AcGal在衰老肿瘤组织中广泛分布。

**2.6 使用DCIP-AcGal进行自然脑衰老的离体成像**
对21月龄自然衰老小鼠和3月龄年轻小鼠进行对比，X-gal染色显示衰老小鼠海马区信号增强。静脉注射DCIP-AcGal后，离体荧光成像显示衰老小鼠脑组织荧光强度约为年轻小鼠的2倍，同时肝脏和肾脏也有荧光增加（可能与代谢和器官衰老相关）。免疫荧光共定位表明，衰老小鼠海马神经元中DCIP-AcGal荧光与p21和γH2AX（DNA损伤标志物）高度共定位，证实其特异性标记衰老细胞。血清生化分析（ALT、AST等）和H&E染色显示，探针注射后24 h未引起肝肾功能损伤或组织病理学异常，表明其具有良好的体内生物安全性。

**总结讨论：**
本研究成功开发了NIR荧光探针DCIP-AcGal，通过乙酰化β-半乳糖与DCI荧光团的协同脂溶性设计，实现了对SA-β-gal的特异性响应，克服了现有探针膜通透性差、依赖瘤内注射及BBB穿透性不足的局限。该探针在体外、体内及离体层面均验证了对衰老细胞的高灵敏度和特异性成像，尤其是在化疗诱导的肿瘤衰老和自然脑衰老模型中展现出非侵入性检测能力。尽管NIR荧光在穿透颅骨时仍受衰减限制，但探针中引入的氟乙基叠氮基团为未来开发NIR荧光-正电子发射断层扫描（PET）双模态探针提供了模块化平台，有望实现更深的组织穿透，从而推动衰老生物学研究和衰老治疗干预的体内实时监测。

**翻译研究结论部分：**
总之，研究人员开发了一种用于灵敏检测和成像衰老细胞的NIR荧光探针DCIP-AcGal。该探针采用DCI衍生的荧光团与乙酰化β-半乳糖基团结合，通过SA-β-gal特异性激活恢复NIR荧光。这一设计结合DCI核心和乙酰化修饰赋予的有利脂溶性，便于全身给药并具备潜在的BBB通透性。DCIP-AcGal实现了对衰老细胞的特异性成像，其激活通过GLB1敲低和溶酶体共定位得到验证。静脉注射后，该探针成功可视化荷瘤小鼠中治疗诱导的衰老，并能穿过BBB评估自然衰老小鼠大脑中衰老细胞的积累。总体而言，这些发现确立了DCIP-AcGal作为研究衰老生物学和监测衰老治疗干预的有力工具。尽管DCIP-AcGal在NIR窗口下取得了这些进展，但光学成像模态在组织穿透深度方面仍有限。例如，本研究中脑衰老的体内成像显示颅骨显著衰减了荧光信号。鉴于该脂溶性探针在衰老成像中的独特优势，研究人员引入了一个模块化点击位点以整合氟元素，其同位素¹⁸F是PET成像中常用的放射性示踪剂。未来的工作将集中于开发NIR荧光-PET双模态探针，以实现更深的组织穿透，从而对脑衰老进行非侵入性体内检测。