综述：吡咯西啶类与赫鲁霉素类：结构独特兼具治疗潜力的真菌聚酮-非核糖体肽杂合生物碱研究进展（开放获取）

《Natural Product Reports》：Pyrrocidines and hirsutellones: distinctive fungal polyketide alkaloid hybrids with intriguing therapeutic applications: a comprehensive updateOpen Access

　　

吡咯西啶类与赫鲁霉素类是一类结构独特的真菌天然产物，其核心特征为独特的宏环与十氢芴骨架稠合，属于聚酮合酶（PKS）与非核糖体肽合酶（NRPS）杂合代谢产物。该类化合物从多种真菌中分离得到，因具有显著的抗菌、抗真菌及抗肿瘤等药理活性而备受关注。研究人员对2005–2025年间报道的52种真菌来源吡咯西啶类与赫鲁霉素类衍生物的结构多样性进行了系统梳理，阐述了其化学性质、生物合成起源、药代动力学特征及构效关系（SARs），并深入评估了该类化合物的治疗潜力，为现代药物研发提供了新的方向。

1. 1.
   引言
   天然产物始终是药物发现的核心源泉，对现代药物化学发展具有重要贡献，其来源涵盖植物、微生物、真菌及海洋生物等类群。经过数百万年的进化，天然产物能够选择性、高效地与生物大分子相互作用，其结构多样性、立体化学复杂性及生物特异性是纯化学合成手段难以实现的，这也使得天然产物成为感染性疾病、肿瘤学及免疫学领域已上市药物的重要来源。微生物（包括真菌与细菌）是天然产物的主要生产者，拥有高度进化的生物合成途径，可产生结构多样且生物活性显著的代谢产物。真菌的次级代谢能力尤为突出，其核心依赖聚酮合酶（PKSs）、非核糖体肽合酶（NRPSs）及PKS-NRPS杂合系统，这些酶作为模块化组装线，能够精准构建含多个立体中心与功能基团的复杂碳骨架，将链延伸、环化及立体化学控制整合为单一协调过程，区别于传统化学合成路线。真菌天然产物涵盖聚酮、生物碱、肽类、萜类及异香豆素等多个类别，许多结构特征在合成化合物库中无对应类似物，已衍生出多种临床重要次级代谢产物，如抗炎化合物虫草素与胶毒素、降胆固醇药物洛伐他汀与普伐他汀、抗肿瘤药物紫杉醇、免疫抑制剂环孢素A与霉酚酸，以及青霉素与头孢菌素等抗生素。研究人员长期致力于生物活性天然产物研究，重点关注具有药理活性的真菌来源天然产物（FNPs），本次综述系统梳理了2005–2025年间从不同真菌菌株中分离的吡咯西啶类与赫鲁霉素类衍生物。现有文献对真菌次级代谢产物及PKS-NRPS衍生代谢产物的研究多将这两类化合物作为真菌生物碱的个例，或作为生物合成与合成研究的示例，早期综述聚焦于PKS-NRPS途径的机理与合成逻辑，未将此类骨架作为独立化学家族进行整合，也未分析其生物学的进化规律。尽管Nicolaou与Sorensen等合成团队完成了标志性全合成工作，证实了立体化学控制与宏环化的策略，并修正了早期结构解析，但相关合成方法的系统评估需另行讨论。近期研究虽拓展了陆生与海洋来源真菌生物碱的覆盖范围，但吡咯西啶类与赫鲁霉素类多作为化合物清单中的孤立条目，缺乏结构多样性、构效关系及生物合成变异的比较分析。目前尚无综述系统整合2005年以来报道的吡咯西啶与赫鲁霉素衍生物，因此研究人员开展了本次覆盖2005–2025年的全面调研，系统收录52种相关衍生物，详述其在不同真菌属中的分布，以及相关的药理活性、生物合成、药代动力学与类药性特征。
2. 2.
   吡咯西啶与赫鲁霉素生物合成的最新进展
   吡咯西啶、赫鲁霉素及结构相关的GKK1032类化合物具有共同的特征分子结构：稠合[6.5.6]三碳环十氢芴骨架通过芳基醚桥连接至高度张力的13元对环芳烷宏环。过去二十年，研究人员对这类含对环芳烷–十氢芴天然产物的复杂生物合成机制开展了大量研究。Oikawa团队以Penicillium sp. 1032GKK为研究对象，通过同位素标记前体饲喂实验，证实GKK1032A₂（12）的生物合成涉及真菌PKS-NRPS杂合系统：[1-¹³C]-L-酪氨酸、[S-¹³CH₃]-L-甲硫氨酸及[1,2-¹³C]乙酸的掺入模式提供了关键证据，[1-¹³C,²H₃]乙酸饲喂实验则表明乙酰辅酶A为起始单元，其末端乙烯基的双氘代特征支持该结论。后续研究提出，高度还原的PKS结构域催化乙酰辅酶A起始单元与8个丙二酰辅酶A延伸单元逐步缩合，链延伸过程中5个S-腺苷甲硫氨酸（SAM）单元为生长链添加甲基，随后聚酮链通过NRPS结构域与L-酪氨酸偶联，释放线性酪氨酸-壬酮醛（B1），经分子内缩合生成3-吡咯啉-2-酮关键中间体（B2），后续环化步骤的多种假设已在相关综述中被系统总结。

Ear团队以玉米内生真菌Acremonium zeae NRRL 13540（同物异名Sarocladium zeae）为对象，通过双标记L-酪氨酸（¹⁸O/¹³C）饲喂实验，明确了吡咯西啶醚键中氧原子的来源为酪氨酸酚羟基，为张力对环芳烷环D的形成提供了实验证据。研究人员提出了线性聚酮B3分子内环化反应的三种可能机制，均最终生成环C与环D，并伴随侧链双键重排得到B4：第一种机制为C1位烯丙基氧化羟基化，随后脱水与双键重排形成环C，酪氨酸酚羟基对生成的碳正离子进行分子内进攻形成对环芳烷环D；第二种途径为C12–C13双键环氧化，C1去质子化引发双键重排与环C形成，脱水后生成与第一种途径相同的碳正离子中间体；第三种可能为酚自由基参与协同环化，同时生成对环芳烷环D与环己烷环C，并在C1位烯丙基氢抽提辅助下完成双键重排。

中间体B6、B7与B4由线性吡咯烷酮B5、B2与B3经初始环化与双键重排生成，可进一步发生分子内狄尔斯–阿尔德（IMDA）反应，形成赫鲁霉素、GKK1032类化合物与吡咯西啶共有的十氢芴环系（B8–B11）。IMDA反应可经内型或外型过渡态进行，分别生成A/B环反式或顺式稠合的非对映异构体。针对赫鲁霉素B（36）十氢芴核心的合成研究表明，化学环境下内型IMDA反应更易发生，提示外型类似物的形成可能需要酶催化。

Ohashi团队对A. zeae（同物异名S. zeae）基因组测序后，鉴定到名为pyd的生物合成基因簇（BGC），其中PydB与参与十氢萘天然产物生物合成的狄尔斯–阿尔德酶具有约40%的序列一致性。研究人员通过异源共表达pyd簇中不同基因组合，结合LC-MS与NMR分析代谢产物，发现初始共表达PydA（PKS-NRPS）、PydC（trans-ER）与PydG（α/β-水解酶）产生三种与预期线性3-吡咯啉-2-酮壬酮中间体B3相关的分流产物B12–B14，提示需要额外酶参与后续生物合成。进一步共表达推测的狄尔斯–阿尔德酶PydB（LLP）与PydE（MDR）未产生新产物。通过与Phialocephala scopiformis及Penicillium citrinum DSM 1997的同源真菌BGC序列比对，鉴定到假设蛋白PydX与PydZ为pyd簇中潜在参与吡咯西啶生物合成的保守成员。共表达全部七种蛋白（PydA/C/G/B/E/X/Z）后，分流产物生成量减少，同时生成吡咯西啶D（B15）——其源于内型IMDA反应，未在A. zeae天然代谢产物中被检测到，而预期产物13（源于外型IMDA反应，具有顺式A/B环系）未生成。四种蛋白（PydB/E/X/Z）的共表达是B15生成的必要条件，缺失任一蛋白均导致B15合成消失。研究人员提出这四种蛋白组装为功能复合体，催化B3转化为B4：聚酮链在中间体B16中呈反向S型构象，使酪氨酸酚基靠近C13；酪氨酸酚去质子化为酚盐后亲核进攻C13烯烃，形成环D，并触发C12向C7位三烯体系的共轭加成，最终闭合环C；NAD(P)⁺辅因子（可能来自MDR）作为氢受体靠近C1完成反应。内型产物B15的生成提示PydB并非催化外型IMDA反应的狄尔斯–阿尔德酶。后续在A. zeae基因组不同重叠群上鉴定到PydY（HP），共表达PydY与前述全部蛋白后成功生成13，而Penicillium citrinum BGC中无PydY同源物，其异源表达后仅生成具有反式A/B环系的GKK1032A₂（12）。由此证实PydY为催化吡咯西啶生物合成中顺式A/B环系形成的外型IMDA反应的狄尔斯–阿尔德酶（周环酶）。

Chen团队通过不同培养基与培养周期培养S. zeae，除已分离的主要代谢产物13与34外，还鉴定到对环芳烷–十氢芴类化合物吡咯西啶D酮式B15、烯醇式B15a及trichobamide B（B17）。通过基因组测序与PKS-NRPS基因系统性失活，确定prc簇为吡咯西啶生物合成的BGC。单基因敲除实验显示：prcI缺失导致13与B15/15a消失，但34仍存在，表明PrcI负责吡咯烷酮环中烯键的还原；prcX缺失导致外型产物（13与34）积累显著减少，同时生成野生型中未检测到的内型产物吡咯西啶E（B18），提示PrcX参与调控IMDA反应向生成外型吡咯西啶的方向进行；prcH缺失不影响吡咯西啶生成，但积累与B3相关的全E型多烯醇分流产物，提示PrcH可阻止PKS-NRPS释放的推测醛中间体B19还原为分流产物，或促进自发Knoevenagel缩合生成B3；prcB缺失导致吡咯西啶无法生成，积累不含特征三甲基环己烷环的分流产物，表明PrcB负责B3的初始环化生成含环C的B20；ΔprcD突变体积累含环C但缺乏下游氧化的中间体，确定PrcD为B20中吡咯烷酮环的羟化酶，催化生成B21；prcE缺失导致生成含环C但无吡咯西啶的分流产物，证实PrcE为张力对环芳烷环D形成的必需酶。PrcB、D、E的功能重组尝试因膜相关PrcB的难溶性及PrcD、E的显著细胞毒性未获成功，向ΔprcB或ΔprcE突变体饲喂推测中间体也未观察到可检测转化。

基于上述结果，Chen团队提出吡咯西啶生物合成路径：PKS-NRPS（PrcA）与其伴侣烯酰还原酶（PrcC）构建线性醛B19，经PrcH催化或辅助的Knoevenagel缩合生成吡咯烷酮B3；PrcB催化环C形成，伴随双键重排生成中间体B20；PrcD对吡咯烷酮部分羟化得到B21；PrcE催化对环芳烷环D形成；PrcX通过外型IMDA反应实现A/B环顺式稠合，生成吡咯西啶A（34），随后经PrcI还原得到13。同源建模与分子对接分析显示，中间体B3的C7–C12段烃链在PrcB活性位点中呈椅式构象，C7位甲基为轴向，C9与C11位甲基为平伏向，与环C的立体化学排布一致。PrcB通过R265对C1位去质子化启动反应，触发多烯链双键异构化，促进C7对C12的分子内进攻生成环C，随后E115对C15质子化；PrcE通过氧化还原活性二硫键作为对环芳烷氧化形成过程中的电子受体，活性位点半胱氨酸与中间体B21的C4′形成半胱氨酸-醌加合物，sp³杂化C4′的引入与芳香性的暂时丧失降低了构象约束，使C13靠近醌氧，随后分子内进攻闭合环D，半胱氨酸释放与再芳香化最终形成特征性扭曲苯环。该机制可解释吡咯西啶与GKK1032A₂中C13位的(S)构型，而Ohashi团队提出的酚盐进攻/共轭加成序列无法合理解释该构型及苯环超过12°的扭曲特征。

Ohashi与Chen团队的研究对象相同但策略不同（异源表达vs逐步单基因缺失），均证实PKS-NRPS参与构建Oikawa提出的线性吡咯林酮壬酮前体，且均明确需要多种辅助蛋白构建张力对环芳烷与十氢芴环。两项研究独立发现PydY/PrcX为催化外型选择性IMDA环化生成顺式A/B环系的关键周环酶，但对上游环化步骤的解析存在差异：Ohashi团队提出多蛋白复合体协同介导氧化环化，Chen团队则明确了单个蛋白的功能，并对Ohashi提出的环化机制提出挑战。两项研究对相同蛋白采用不同命名，相关基因名称与实验验证功能的对比可参见对应表格。

Liu团队对中国红树林内生真菌Xylaria sinensis ML-31中结构相关的xenoacremones的生物合成开展研究，通过基因组测序、生物信息学分析及基因缺失与异源表达结合代谢物鉴定，确定xen BGC负责xenoacremone合成。研究提出生物合成路径：XenE（PKS-NRPS）与其伴侣XenG（trans-ER）催化生成仅含两个甲基取代的酪氨酸-壬酮衍生物（类似B3）；α/β-水解酶XenA催化吡咯烷酮缩合产物形成；三种假设蛋白分别负责后续转化：XenF（PrcB/PydB同源物）通过[1,11]-σ迁移重排催化环C形成，XenD（PrcD/PydX同源物）在吡咯烷酮环上引入环氧化物，XenC（PrcE/PydZ同源物）形成对环芳烷环。该路径逻辑与前人研究相似，但假设IMDA反应自发进行，未鉴定到负责立体选择性的关键周环酶（PrcX/PydY）同源物。

综合来看，PKS-NRPS来源线性壬酮中间体的环化步骤生物合成逻辑仍存在争议。Ohashi团队首次实现途径的异源重构，但提出的多辅助蛋白（PydB/E/X/Z-PrcB/I/D/E）协同氧化环化级联反应未明确各酶的具体作用与反应顺序，其酚盐进攻/共轭加成序列也无法合理解释C13的(S)构型与苯环扭曲特征。Chen团队通过野生型菌株单基因缺失明确了各酶的分步功能，提出PydZ/PrcE为对环芳烷形成酶，并通过计算模拟解释了芳香环扭曲的机制——活性位点内半胱氨酸-醌加合物的瞬时脱芳香化降低了对环芳烷形成的能垒。Liu团队通过基因缺失与异源表达结合解析了Xylaria sinensis中xenoacremone的生物合成途径，提出XenF（PydB/PrcB同源物）催化σ迁移重排构建环C，但该假设被Chen团队的同源建模与分子对接结果质疑：中间体B3的C1与C15原子在活性位点中距离约10 ?，无法满足协同σ迁移氢迁移的过渡态空间要求，Chen团队提出由保守四联体（R265、D87、E85与E118）介导的碱催化异构化-环化机制，其中R265作为广义碱对C1位末端甲基去质子化，启动多烯链的双键异构化级联反应。尽管Chen团队的逐步模型在化学机制上更具合理性，但仍存在局限：PydB/PrcB、PydX/PrcD与PydZ/PrcE的功能分配主要依赖计算机模拟分析，缺乏直接生化证据；异源表达失败（可能因蛋白难溶与细胞毒性）导致关键机制假设（如PrcB的精氨酸介导去质子化、PydZ/PrcE的瞬时脱芳香化）仍属推测；突变体分离并表征的代谢物为稳定的分流产物，而非确认的活性途径中间体，因此无法完全否定Ohashi团队提出的协同氧化环化模型。

十氢芴核心形成的最终步骤为IMDA反应，该步骤决定了顺式稠合吡咯西啶（源于外型过渡态）与反式稠合GKK1032类化合物及赫鲁霉素（源于内型过渡态）的结构差异。内型模式在化学上更易发生，但吡咯西啶产生生物中 exclusiv外型选择性加合物的生成表明需要酶调控。Ohashi团队最初鉴定PydY/PrcX为该化学不利外型环化步骤的必需周环酶，但Chen团队发现ΔprcX突变体中仍可微量生成顺式稠合吡咯西啶，提示PydY/PrcX可能通过活性位点形状互补作为构象模板调控过渡态流形，而非共价催化剂。Liu团队提出xenoacremone生物合成中IMDA步骤为非酶促自发反应，但该分配可能不完整：Chen团队重新分析xen基因座，在BGC边界鉴定到截短的pydY/prcX同源物xenX，鉴于PrcX/PydY在吡咯西啶生物合成中的立体导向作用，且Liu团队的XenX缺陷型异源重构仅微量生成xenoacremone并伴随额外异构体峰，XenX可能是xenoacremone生物合成中终端IMDA反应的缺失因子。

狄尔斯–阿尔德酶是催化天然产物生物合成途径中[4 + 2]环加成反应、加速反应速率或控制立体化学的一类功能多样的酶，并非具有共同蛋白折叠的单一酶家族，而是独立进化自多个不相关酶类，包括氧化还原酶、甲基转移酶及脂钙蛋白样合酶等。其功能涵盖从加速反应速率的 standalone 周环酶，到主要作为“熵阱”预组织底物以偏好特定区域与立体化学结果的酶或结构域。脂钙蛋白样十氢萘合酶即为典型的熵阱，例如参与十氢萘–四酸衍生物Sch 210972生物合成的CghA，ΔCghA突变体中线性前体自发环化生成内型与外型产物的混合物；equisetin生物合成途径中的Fsa2负责内型选择性十氢萘形成，ΔFsa2突变体中不稳定中间体自发环化导致立体化学保真度丧失，同时生成内型与外型加合物。吡咯西啶生物合成中的PydY/PrcX脂钙蛋白样蛋白被认为具有类似功能，ΔprcX突变体中微量外型产物的生成提示其可能作为构象模板偏倚过渡态流形，而非反应的绝对必需因子。未来需通过体外酶活实验量化催化速率提升与立体化学控制能力，并结合高分辨率底物或中间体结合晶体结构，明确PydY/PrcX是真正的周环酶还是被动构象模具。

1. 3.
   吡咯西啶与赫鲁霉素的化学与生物学
   截至目前，已从多种真菌属中分离得到55种吡咯西啶与赫鲁霉素衍生物，研究人员按产生菌的真菌分类学层级进行归类阐述，并详述其已报道的生物活性。为区分章节标识，第2节中生物合成途径与前体采用字母标识（A、B、C），第3节中分离化合物及其衍生物采用阿拉伯数字连续编号。

3.1 座囊菌纲真菌

3.1.1 格孢菌亚纲

3.1.1.1 格孢菌目

3.1.1.1.1 壳二孢科

3.1.1.1.1.1 壳二孢属（MycoBank ID 1548）

研究人员对中国广西采集的阔苞菊内生真菌Didymella sp.的化学成分开展研究，分离得到两个新型聚酮生物碱衍生物phomapyrrolidone C（1）与phomapyrrolidone A（2），以及三个新型类似物ascomylactams A（3）、B（4）与C（5）。以EPI为阳性对照，采用MTT法检测上述化合物对MDA-MB-435、SNB19、HCT116、NCI-H460与PC-3肿瘤细胞的细胞毒性，结果显示所有化合物活性较弱至中等，IC₅₀值为4.9至>50 μM，而阳性对照IC₅₀值为0.12–5.7 μM。Ariantari团队从印度尼西亚巴厘岛南部采集的榄仁叶内生真菌Didymella sp.中分离得到didymellanosine（6）——首个与腺苷偶联的吡咯西啶衍生物，同时分离得到前述类似物2与5。化合物6对L5178Y肿瘤细胞的细胞毒性强于阳性对照kahalalide F，IC₅₀值分别为2.0 μM与4.3 μM；对Ramos与Jurkat J16人肿瘤细胞系的IC₅₀值分别为3.3 μM与4.4 μM，对MRC5细胞的IC₅₀值为21.2 μM，显示其对肿瘤细胞具有轻度选择性；同时具有中等NF-κB抑制活性，IC₅₀值为45.4 μM。抗菌活性测试显示，化合物2对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌与屎肠球菌具有弱抑制活性；化合物5与6对上述革兰阳性菌的MIC值为3.1–12.5 μM，对革兰阴性菌鲍曼不动杆菌的MIC值分别为3.1 μM与3.1 μM，活性显著优于化合物2。

3.1.1.1.1.2 茎点霉属（MycoBank ID 9358）

研究人员从种子内生真菌Phoma sp.中分离得到新型聚酮生物碱类似物phomapyrrolidone B（7），同时得到前述类似物1与2。以利福平与异烟肼为阳性对照，采用MABA与LORA法检测抗结核活性，结果显示化合物活性较弱，MIC值分别为5.2–13.4 μM、20.1–41.1 μM、0.07–0.1 μM、5.2–13.4 μM与0.03–>17.5 μM；对Vero细胞的细胞毒性检测显示，所有化合物活性强于利福平，IC₅₀值分别为19.4 μM、17.7 μM、17.1 μM与109.0 μM；在最高测试浓度下，所有化合物对人肿瘤细胞系无抗增殖活性。

3.1.1.1.2 格孢菌科

3.1.1.1.2.1 Embellisia属（MycoBank ID 127066）

研究人员从摩洛哥采集的Cladanthus arabicus茎中分离得到植物内生真菌Embellisia eureka，从中获得两个新型聚酮生物碱衍生物embellicines A（8）与B（9）。细胞毒性测试显示，化合物8对K562细胞的IC₅₀值在8、24、48、72 h分别为3.473 μM、2.855 μM、1.282 μM与1.202 μM；化合物9对K562细胞的IC₅₀值分别为0.92 μM、0.32 μM、0.25 μM与0.21 μM，对A549细胞具有类似活性，对PBMC细胞具有中等细胞毒性，IC₅₀值为12.8 μM。两种化合物均可抑制TNFα诱导的NF-κB转录活性，IC₅₀值分别为3 μM与0.35 μM；化合物9对K562与A549肿瘤细胞的抗增殖活性在浓度≥0.5 μM时表现显著。