《Natural Product Reports》：Bacterial cytological profiling for mode-of-action discovery of natural product-derived antibiotics: progress, challenges, and future directionsOpen Access
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抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）的快速升级已超越天然产物（natural product, NP）衍生抗生素的发现速度，凸显了对新策略以识别和表征抗菌剂的需求。由于结构和机制多样性，NP在历史上主导了抗生素开发，但其
抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）的快速升级已超越天然产物（natural product, NP）衍生抗生素的发现速度，凸显了对新策略以识别和表征抗菌剂的需求。由于结构和机制多样性，NP在历史上主导了抗生素开发，但其化学复杂性、低丰度、繁重的去重化（dereplication）以及具有挑战性的作用机制（mode of action, MoA）鉴定持续限制了发现效率。细菌细胞学图谱（Bacterial Cytological Profiling, BCP），一种基于图像的表型筛选方法，已成为一种强大手段，能够捕获丰富的、单细胞分辨的响应，使其特别适用于研究复杂NP衍生抗生素的发现。本综述聚焦于BCP，一种原核生物基于图像的策略，在抗生素MoA阐明中处于核心地位，如何应对NP衍生抗菌发现中的关键挑战，包括去重化、多MoA的解卷积以及新机制的鉴定。研究人员还讨论了该方法当前在生物学和方法学上的局限性，并为寻求在发现项目中实施BCP的NP研究人员提供了实用视角。最后，研究人员探讨了广泛采用的真核基于图像分析方法——细胞绘画分析（Cell Painting Assay, CPA）的经验教训如何为未来BCP的发展提供启示，并提出了一个“BCP v1.0”框架，以促进更广泛的采用，并最终加速NP衍生抗生素的发现。
**1. 引言（Introduction）**
抗生素发现自1950年代黄金时代后进入长期衰退，而抗生素耐药性危机加速，威胁现代医学基础。尽管近年出现zosurabalpin、gepotidacin、zoliflodacin等首创抗生素，但创新速度仍不足。天然产物（NP）尤其是微生物次级代谢产物，在抗生素发现中占主导地位，但面临化学复杂性、低丰度、去重化（dereplication）及早期作用机制（MoA）阐明等挑战。传统MoA测定方法（如靶向生化分析、遗传筛选、多组学等）各有局限，基于图像的表型分析（image-based profiling）作为一种信息丰富的技术应运而生，可实现无偏机制发现。
**2. 基于图像的表型分析在抗生素MoA发现中的兴起（Emergence of image-based phenotypic profiling for antibiotic MoA discovery）**
细胞形态学是整合表型，反映细胞对扰动的生理响应。作用于相同途径的化合物产生相似细胞学特征，即使结构不同；结构相似但靶点不同的化合物则产生不同形态。基于此原理，可构建参考形态图谱用于MoA聚类、靶点预测和途径注释。基于图像的表型分析作为功能优先策略，可直接处理复杂混合物，减少纯化依赖，并辅助去重化。本综述聚焦于细菌细胞学图谱（BCP），一种原核成像框架，专用于抗生素MoA阐明。
**3. 细菌细胞学图谱（BCP）**
BCP源于发现抗生素通过相似机制诱导细菌独特的形态学和细胞学变化。与真核成像不同，BCP因细菌体积小、结构简单、种间差异大，最初未优先考虑高通量，而是建立概念普适性及单细胞分辨率的表型分辨率。关键进展包括：2012年首次在细菌中应用细胞学分析；2013年建立大肠杆菌核心BCP方法；2014年整合MS/MS引导的基因组挖掘；2016年实现粗提物分析、琼脂平板BCP、革兰氏阳性菌系统实施、快速抑制分析（RIP）、以及抗生素敏感性测试（BCP as AST）；2019年应用于鲍曼不动杆菌；2021年用于干扰化合物（PAINS）鉴定；2023年单细胞BCP实现>90%分类准确率；2025年深度学习辅助BCP（Myco-BCP）用于结核分枝杆菌。
**4. BCP在NP衍生抗生素MoA研究中的应用（Applications of BCP in NP-derived antibiotics MoA study）**
BCP已成功阐明多种抗菌剂的MoA，包括二苯基脲、苯基噻唑取代氨基胍、芳基噻唑、thailandamide等。部分化合物如mansonone G、ENOblock、松萝酸（usnic acid）通过BCP发现新MoA。表2列出按时间顺序的化合物，包括来源、BCP平台、关键细胞学特征及主要MoA。此外，虽未直接使用BCP，但细菌形态学响应在指导MoA分配中起核心作用，如darobactin、teixobactin、SCH-79797、amycomicin、zosurabalpin等。
**5. 利用BCP挖掘噬菌体编码的抗菌物质（Mining phage-encoded antibacterials using BCP）**
噬菌体作为遗传编码抗菌蛋白和肽的潜在来源，其感染期间通过“预杀机制”（MOK）靶向必需细菌途径，诱导显著细胞学变化。BCP可将噬菌体诱导的细胞学特征与靶向途径关联。例如，vibriophage KVP40诱导的圆形形态与mecillinam处理相似，提示细胞壁合成抑制，后续鉴定出裂解性转糖苷酶（LT）作为抗菌效应物。从NP发现角度看，噬菌体编码抗菌因子可视为一类独特的遗传编码NP，BCP为发现和表征此类抗菌物质提供可扩展的功能筛选平台。
**6. 利用BCP应对NP衍生抗生素发现中的关键挑战（Addressing key challenges in NP-derived antibiotic discovery using BCP）**
BCP直接检测单个细胞在扰动后的表型响应，特别适合NP衍生抗生素发现。
**6.1 枯草芽孢杆菌粗提物的混合物复杂性、低代谢物丰度及去重化**：BCP直接应用于粗提物，无需预分馏即可解卷积多种抗菌活性，如蛋白质翻译抑制和膜通透化，并引导活性导向纯化。鉴定出bacillaene为翻译抑制剂，subtilosin和产孢致死因子（SKF）为膜破坏表型。BCP在低体积（15 μL）下仍敏感，并适应琼脂平板上的直接分析，实现菌株早期功能筛选。
**6.2 松萝酸的多重MoA**：单细胞BCP揭示松萝酸与colistin联用时诱导多种MoA，包括RNA转录抑制、DNA复制应激及蛋白质合成次级效应，表明其具有多MoA性质，而非单一主导响应。
**6.3 Mansonone G的新型细胞学特征**：BCP确定mansonone G主要通过膜通透化发挥抗菌活性，但未明确分子靶点，需进一步遗传、生化或化学蛋白质组学方法确认。该案例说明BCP可快速提供途径水平MoA，但分子靶点分辨率有限。
**7. BCP用于MoA推断的解释局限（Interpretative limits of BCP for MoA inference）**
最全面的参考数据集基于2013年LPS缺陷大肠杆菌lptD4213菌株，存在以下局限：
**7.1 不同抗生素类别产生的冗余细胞学特征**：高浓度利福平可诱导DNA凝聚，类似翻译抑制表型；暴露时间延长可导致次级效应，如甲氧苄啶（trimethoprim）长时间处理产生类似DNA复制抑制剂表型。标准BCP协议（1–2小时，1–5×最小抑菌浓度（MIC））可减少此类影响。
**7.2 同一抗生素类别内的表型变异**：β-内酰胺类中PBP2和PBP3抑制产生不同形态，但仍在一致特征空间内，可通过表型分布空间改进分类。
**7.3 膜靶向化合物的解释模糊性**：膜活性剂表现出强浓度依赖性，如多粘菌素（polymyxin）在低浓度时显示信息性表型，建议跨浓度范围分析。
**7.4 有限的分子分辨率**：BCP提供途径水平分类，靶点确认需补充方法，如耐药突变体选择、化学蛋白质组学等。表3提供实用故障排除指南，针对常见观察结果（如细胞裂解、混合表型等）提出解释和后续步骤。
**8. BCP的方法学挑战与改进机遇（Methodological challenges and emerging opportunities for improving BCP）**
**8.1 实验室准备**：包括样品制备和图像采集。
**8.1.1 样品制备**：活细胞成像存在时间限制，化学固定可解耦处理与成像时间，提高通量并保障生物安全（如结核分枝杆菌）。琼脂糖垫片局限可通过微图案化平台（如CapsuleHotel）克服。
**8.1.2 图像采集**：BCP通常需要100×油镜，低放大倍数（60×或63×）可增加每视野细胞数，便于自动化高内涵成像。非荧光成像（如无标记方法）是降低仪器要求的潜在方向。
**8.2 图像数据分析**：包括目标检测、特征提取、数据准备和数据分析。
**8.2.1 目标检测与特征提取**：CellProfiler和机器学习方法（如ilastik）可提取手工特征，但存在人工偏差；深度学习（如Myco-BCP）无需显式分割，适用于难成像物种。对于NP实验室，手工特征为实用入口。
**8.2.2 数据准备**：机器学习辅助异常值检测（如HDBSCAN）和特征选择（如RFECV结合支持向量机SVM）可减少噪声和偏差，提高数据质量。
**8.2.3 数据分析**：传统主成分分析（PCA）可能忽略细微表型，深度学习（DL）可学习判别模式，但需要大数据集，存在过拟合风险。无监督学习和迁移学习是未来方向。
**9. 细胞绘画分析对BCP和NP发现的启示（Lessons from the cell painting assay for BCP and NP discovery）**
细胞绘画分析（CPA）通过多路复用细胞学分析，已建立标准化协议、公开数据资源（如JUMP Cell Painting联盟），实现大规模应用。BCP目前仍处于早期采用阶段，缺乏跨实验室标准化、集中形态图谱和社区基准。CPA经验表明，生态系统级进展（标准化协议、开放存储库、社区基准）与技术创新同等重要。
**10. 走向标准化“BCP v1.0”的道路（Road to a standardized “BCP v1.0”）**
提出最小标准化BCP协议建议：
**10.1 细菌菌株**：推荐使用LPS缺陷大肠杆菌作为参考系统，对广谱抗生素敏感，便于早期MoA洞察。长期可扩展至WHO优先病原体（如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌）。
**10.2 参考抗生素数据集**：至少包括DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译、细胞壁合成抑制剂，提供可区分细胞学特征。
**10.3 染料**：最小染色组合推荐FM4-64（1 μg/mL）和DAPI（2 μg/mL），省略SYTOX Green以减少固定伪影。DAPI强度可间接指示膜通透性。
**10.4 固定**：推荐使用多聚甲醛（2.5%）和戊二醛（0.04%）固定液，染色后固定以保持形态。
**10.5 放大倍数**：100×油镜为首选，60×为可行入口，需保证分割质量。
**10.6 化合物浓度**：推荐1×、2×和5×最小抑菌浓度（MIC）系列，以捕获浓度依赖性表型。
**10.7 暴露时间**：1–2小时为标准，可捕获主要细胞学响应。
**10.8 分析流程**：CellProfiler为实用起点，可开发专用插件；深度学习（DL）为长期替代方案。
**10.9 公共数据存储库**：建立共享图像资源，包括临床相关NP衍生抗生素和PAINS化合物，支持去重化和多药组合分析。
