通过合成菌群增强 4-氯苯胺降解：功能基因互补性、反馈抑制缓解、转录组学以及生物降解途径与机制

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Enhancing 4-chloroaniline degradation by a synthetic consortium: Functional gene complementarity, feedback inhibition alleviation, transcriptomics, and biodegradation pathways and mechanisms

　　

摘要

微生物共代谢是一种降解顽固污染物 4-氯苯胺 (4-CA) 的绿色有效方法，其中交叉喂养和竞争等微生物相互作用起着至关重要的作用。本研究筛选了四种能够降解氯代芳香族化合物的菌株。基于关键基因的互补性和降解底物的差异，我们构建了一个高效的 4-CA 降解菌群 C1。在 7 天内，C1 对 4-CA (75?mg/L, pH 8) 的降解率达到 79.93%。它由三个菌株组成：施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri) CPA-1、罗氏菌属 (Rhodococcus sp.) CPA-5 和葡萄球菌属 (Staphylococcus sp.) CPA-6。虽然 CPA-5 不能直接降解 4-CA，但它利用 CPA-1 和 CPA-6 释放的有毒中间体 4-氯儿茶酚，从而缓解毒性抑制并促进 4-CA 的降解。整合基因组、宏转录组、酶学和中间体产物分析表明，菌群 C1 拥有更丰富的核心降解基因和途径。通过各种酶催化的脱氨、羟基化、开环和脱氯作用，C1 矿化 4-CA，菌株间的代谢交叉喂养消除了有毒中间体的反馈抑制。菌群构建上调了许多功能基因，包括核心降解途径基因、解毒和氧化应激防御基因、DNA/蛋白质损伤修复基因以及细胞代谢/分裂/电子传递基因。C12O 和 C23O 活性的增强使得 4-CA 能够同时且高效地进行邻位和间位裂解，进一步提高了其降解效率。本研究为修复 4-氯苯胺污染提供了一种基于共代谢的新策略。

引言

随着工业化的快速发展，大量氯代芳香族化合物被释放到环境中。这些化合物广泛用于农药、杀虫剂、阻燃剂、塑料和纸浆中。它们化学性质稳定，不易生物降解，倾向于在生物体内积累，对人类健康和生态系统构成威胁 [1]。4-氯苯酚 (4-CP) 和 4-氯苯胺 (4-CA) 分别是氯苯酚类和氯苯胺类的典型代表 [2], [3]。4-CP 是一种典型的内分泌干扰物。长期暴露会对人类健康和生态系统造成严重的不良影响，已被许多国家列为优先控制污染物，并被世界卫生组织归类为潜在致癌物 [4], [5]。4-CA 常用作合成有机化学品和聚合物（如聚氨酯、橡胶添加剂、染料、药品、化妆品和农药）生产中的中间体 [1], [6]。4-CA 会刺激和损伤皮肤和眼睛，导致人类中枢神经系统损伤、组织缺氧以及多个内脏器官癌变 [7]。它被世界卫生组织归类为 2B 类致癌物。因此，氯代芳香族化合物污染的修复是全球面临的共同挑战。

以往的研究表明，吸附、热解、膜分离、光催化氧化和电化学氧化等物理化学方法可以有效降解氯代芳香族化合物 [8], [9], [10]。与这些往往存在二次污染、能耗高和污染物去除不彻底的方法相比，生物修复环境友好、性价比高，并且能够实现污染物的完全矿化 [11], [12], [13]。目前，关于微生物和氯代芳香族化合物的研究主要集中在筛选高效降解菌株和共代谢 [14]。参与氯代芳香族化合物降解的细菌属包括假单胞菌 (Pseudomonas)、不动杆菌 (Acinetobacter)、罗氏菌 (Rhodococcus) 和葡萄球菌 (Staphylococcus) [15], [16], [17], [18]。例如，Zhu 等人证明苯胺可以增强假单胞菌对 4-CA 的去除 [19]。然而，在共代谢中，目标污染物不能为微生物生长提供碳源或能量 [20]。一旦初级底物耗尽，降解就会停止。此外，有毒中间体可能会在过程中积累以抑制微生物活性 [21], [22]。单一菌株通常只拥有针对特定结构的酶，导致对顽固物质的降解效率低 [23]。竞争和合作是微生物间常见的相互作用，共代谢交叉喂养是一种常见的合作形式，微生物利用邻近生物的代谢中间体来维持生存。微生物之间存在涉及交叉喂养和共降解的双向生态关系 [24], [25], [26]。以往的研究表明，罗氏菌属菌株 p52 与非降解细菌 W60 和 D10 形成互利交叉喂养关系。W60 和 D10 利用 p52 介导降解过程中产生的中间体水杨酸和龙胆酸，这有助于消除这些中间体的毒性积累并促进二苯并呋喃的降解 [27], [28]。作为一种典型的非竞争性抑制剂，4-氯儿茶酚 (4-CC) 是关键中间体，其降解限制了 4-CA 生物降解的整体速率 [29]。4-CC 不与底物竞争活性位点，而是结合到开环酶的别构位点，改变其构象并降低催化活性 [12]。因此，有效消除 4-CC 对于提高 4-CA 降解效率至关重要。因此，可以使用全基因组分析来分析特定酶的功能基因，并结合降解特性来精确构建微生物菌群。通过交叉喂养，菌株可以利用彼此的代谢产物 [30]，缓解有毒中间体的反馈抑制 [19]，并激活酶表达以实现有效降解 [31]。这种方法对于修复氯代芳香族化合物污染具有重要意义。目前，关于 4-CA 降解能力菌株的研究不如 4-CP 广泛，研究主要集中在优化外部碳源的降解性能和阐明降解途径 [14], [19]。关于使用微生物菌群进行 4-CA 共代谢的研究有限。因此，有必要筛选和构建 4-CA 降解菌群以提高降解效率。通过结合基因组学、转录组学和 LC-MS/MS，我们可以深入探索菌群内的相互作用机制，鉴定新的降解基因和代谢途径，并阐明微生物共代谢的机制。

研究目标是 (1) 筛选 4-CP 和 4-CA 降解菌株并注释其功能基因；(2) 利用降解特性和遗传互补性构建 4-CA 降解共代谢菌群；(3) 通过宏转录组富集和差异表达鉴定关键共代谢基因 (catA, catE, cypD_E, katE, gshA)，确认交叉喂养和菌株贡献；(4) 使用 LC-MS/MS 分析降解途径；(5) 通过关键酶活性和中间体测量揭示增强 4-CA 降解的机制。本研究丰富了降解 4-CA 微生物菌群内代谢交叉喂养的分子理论，并为构建用于生物修复受 4-CA 污染碱性水体的微生物制剂提供了可行的策略。

章节摘要

化学品与菌种

纯度至少为 98% 的 4-CP 和 4-CA 购自中国上海麦克林生化科技有限公司。本研究中使用的化学品均为分析纯或更高纯度。4-CP 和 4-CA 的储备液分别通过将 1?g 4-CP 或 1?g 4-CA 溶解在 100?mL 甲醇中制备，以获得 10?g/L 的最终浓度。储备液储存在 4 ℃ 避光密封容器中，并在两周内使用，以防止光降解或挥发

有机氯降解细菌的分离、鉴定及降解性能

从有机氯化合物污染的土壤中分离和纯化出四株细菌，分别命名为 CPA-1、CPA-2、CPA-5 和 CPA-6。测定了这些菌株在 7 天内对 4-CP 和 4-CA 的降解效率 (图 1)。其中，菌株 CPA-1 在 7 天内对 100?mg/L 的 4-CA 降解率达到 48%。菌株 CPA-2 在 7 天期间对 4-CP 和 4-CA 的降解性能均较差，降解率分别为 28.28% 和

结论

本研究分离了四株 4-氯苯胺 (4-CA) 降解菌株。基于基因互补性和底物差异，构建了一个由施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri) CPA-1、罗氏菌属 (Rhodococcus sp.) CPA-5 和葡萄球菌属 (Staphylococcus sp.) CPA-6 组成的三菌株菌群 C1。C1 在 7 天内对 4-CA 的降解率达到 79.93% (pH 8, 75?mg/L)。虽然罗氏菌属 (Rhodococcus sp.) CPA-5 不能单独降解 4-CA，但它利用 CPA-1 和 CPA-6 释放的有毒中间体 4-氯儿茶酚，缓解了

CRediT 作者贡献声明

刘启友：写作 - 审阅与编辑，监督，项目管理，方法论，资金获取，概念化。李双双：写作 - 审阅与编辑，方法论。吴飞：方法论，数据整理。牛奕学：写作 - 审阅与编辑，写作 - 初稿，软件，方法论，调查，概念化。杜良真：方法论。博永林：方法论，数据整理，概念化。苏玉华：写作 - 审阅与编辑，写作 - 初稿，

竞争利益声明

所有作者声明，他们没有已知可能影响本论文报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了重油加工国家重点实验室和中央高校基本科研业务费的资助 (项目编号：24CX02020A)

牛奕学 | 李双双 | 吴飞 | 博永林 | 苏玉华 | 杜良真 | 刘启友

中国石油大学 (华东) 化学工程学院，山东 青岛 266580，中国