小胶质细胞去泛素化酶OTUD7B通过稳定STAT3促进阿尔茨海默病中的神经炎症和认知衰退

《Advanced Science》：Microglial Deubiquitinase OTUD7B Stabilizes STAT3 to Promote Neuroinflammation and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease

　　

由小胶质细胞激活驱动的神经炎症是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的一个定义性特征，然而维持这种促炎状态的分子机制仍不清楚。在此，研究人员发现去泛素化酶OTUD7B（OTUD7B）是小胶质细胞激活和AD病理的关键调节因子。OTUD7B表达在AD小鼠模型和人类患者数据集的小胶质细胞中显著升高。OTUD7B的基因敲除显著减弱了小胶质细胞激活和细胞因子释放，减轻了神经元损伤，并改善了AD小鼠的认知表现。机制上，OTUD7B直接与STAT3（信号转导及转录激活因子3，STAT3）相互作用，并去除赖氨酸283（K283）处的K48连接泛素链（K48-linked ubiquitin chains），从而稳定STAT3，促进其核转位，并增强促炎介质的转录。整合转录组分析揭示，OTUD7B缺失抑制了小胶质细胞中的促炎转录程序。总之，这些发现揭示了一个维持小胶质细胞驱动的神经炎症的OTUD7B-STAT3信号轴，并确定OTUD7B是减轻AD神经退行性病理的潜在治疗靶点。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是全球最常见的痴呆症类型，其病理机制复杂，涉及Aβ沉积、Tau蛋白异常和神经炎症等多方面。尽管基于淀粉样蛋白级联假说的药物开发占主导地位，但临床试验失败率高达98%，目前仍缺乏有效延缓或阻止疾病进展的治疗手段。近年来，神经炎症被确认为AD发病的关键组成部分，其中小胶质细胞激活是核心驱动因素。全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出超过25个AD风险基因，多数与神经炎症或小胶质细胞特异性表达相关。然而，维持小胶质细胞促炎状态的分子机制尚不明确。去泛素化酶（DUBs）通过去除底物上的泛素链维持蛋白质稳态，其失调与神经退行性疾病密切相关。卵巢肿瘤蛋白（OTU）家族是DUBs的第二大亚类，其中OTUD7B（也称Cezanne）已知参与炎症调控，但它在AD中的作用尚未被系统研究。因此，研究人员旨在探索OTUD7B是否通过调节小胶质细胞功能参与AD神经炎症，并揭示其分子机制。

研究人员通过整合公共转录组数据集（GSE236562、GSE5281、GSE173955）筛选差异表达的DUBs，发现OTUD7B在AD患者和AD小鼠模型（3×Tg、APP/PS1、Aβ输注小鼠）的小胶质细胞中显著上调。随后，利用小胶质细胞特异性OTUD7B条件性敲除小鼠（OTUD7B^CKO）和腺相关病毒（AAV9）介导的敲低模型，结合Aβ输注的急性AD模型和3×Tg慢性AD模型，通过行为学测试（Morris水迷宫、新物体识别）、免疫荧光、Western blot、RT-qPCR、流式细胞术、免疫共沉淀（Co-IP）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、泛素化分析、CHX脉冲追踪、ChIP-qPCR及STAT3抑制剂（Stattic）实验，系统研究了OTUD7B的功能与机制。研究结果揭示了OTUD7B通过去泛素化STAT3驱动小胶质细胞神经炎症的轴，并表明OTUD7B是AD的潜在治疗靶点。该论文发表在《Advanced Science》。

主要关键的技术方法包括：公共数据库转录组分析（GSE236562、GSE5281、GSE173955，人类AD患者样本来源），小胶质细胞特异性OTUD7B敲除小鼠（OTUD7B^CKO，通过Cx3cr1-Cre与OTUD7B^f/f小鼠杂交获得），AAV9介导的微胶质细胞特异性shRNA敲低，Aβ寡聚体立体定位注射构建急性AD模型，3×Tg小鼠（携带APP^Swe、MAPT^P301L、PSEN1^M146V突变）作为慢性模型，行为学测试（Morris水迷宫、新物体识别），免疫荧光和免疫组化，Western blot，RT-qPCR，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），免疫共沉淀（Co-IP），泛素化分析（利用K48/K63突变体及点突变），CHX脉冲追踪，核质分离，ChIP-qPCR，STAT3抑制剂Stattic给药实验。

3.1 OTUD7B表达在AD患者和AD小鼠模型脑组织中升高。通过分析三个独立公共转录组数据集（GSE236562、GSE5281、GSE173955），结合qPCR和Western blot验证，发现OTUD7B在AD患者和AD小鼠模型（3×Tg、APP/PS1、Aβ输注小鼠）脑组织中显著上调。免疫荧光共定位显示OTUD7B主要表达在NeuN（神经元标志物）和Iba1（小胶质细胞标志物）阳性细胞中，在GFAP（星形胶质细胞标志物）阳性细胞中表达较弱。

3.2 小胶质细胞OTUD7B促进Aβ诱导的体外炎症。在BV2小胶质细胞中，Aβ刺激时间依赖性和剂量依赖性地上调OTUD7B蛋白水平；siRNA沉默OTUD7B显著抑制Aβ诱导的促炎因子（Tnf、Il1b、Il6）mRNA表达，而OTUD7B过表达则加剧炎症。在SH-SY5Y神经元中，OTUD7B沉默不影响Aβ诱导的细胞凋亡或Bcl-2/Bax比率。条件培养基实验表明，OTUD7B沉默的BV2细胞上清可减轻SH-SY5Y神经元凋亡，提示小胶质细胞OTUD7B通过非细胞自主方式影响神经元存活。

3.3 小胶质细胞特异性OTUD7B敲低改善3×Tg AD小鼠的认知缺陷和神经炎症。通过AAV-shOTUD7B注射至3×Tg小鼠海马，行为学测试（新物体识别和Morris水迷宫）显示，OTUD7B敲低显著提高小鼠对新物体的偏好、探索时间和平台穿越次数，减少逃避潜伏期，表明空间记忆和识别记忆改善。免疫荧光显示，OTUD7B敲低减少海马神经元丢失（NeuN）和小胶质细胞激活（Iba1），降低凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比率，并抑制Tnf、Il1b、Il6 mRNA表达。ELISA检测显示Aβ40/42水平未受影响。

3.4 小胶质细胞OTUD7B缺失减轻Aβ诱导的急性AD模型中的神经炎症和认知损伤。在OTUD7B^CKO小鼠中，Aβ海马注射后行为学测试（新物体识别和Morris水迷宫）显示，与OTUD7B^f/f+Aβ组相比，OTUD7B^CKO+Aβ组小鼠探索时间增加、逃避潜伏期缩短、平台穿越次数增加。组织学分析显示，OTUD7B缺失减轻神经元丢失和小胶质细胞激活，抑制凋亡（Bcl-2/Bax比率上调）和炎症因子表达。

3.5 OTUD7B直接与STAT3相互作用。通过Co-IP结合LC-MS/MS筛选，鉴定STAT3为OTUD7B的潜在相互作用蛋白。内源性Co-IP验证两者在3×Tg小鼠脑、Aβ输注小鼠脑及Aβ处理BV2细胞中结合。外源性Co-IP证实HEK293T细胞中Flag-OTUD7B与His-STAT3结合。通过STAT3结构域缺失突变体分析，发现SH2（Src同源2）结构域介导两者相互作用。

3.6 OTUD7B通过去除K48连接泛素链稳定STAT3。siRNA沉默OTUD7B降低BV2细胞中STAT3总蛋白和磷酸化p-STAT3水平，但不影响mRNA；CHX脉冲追踪实验显示OTUD7B缺失加速STAT3降解，过表达则延缓降解。泛素化实验表明，OTUD7B去除K48连接泛素链（而非K63），且K48R突变体（泛素K48R）消除此效应。通过预测和点突变，鉴定赖氨酸283（K283）为关键位点，K283R突变阻断OTUD7B的去泛素化作用和稳定效应。K283在多个物种中高度保守。

3.7 OTUD7B缺失抑制STAT3-NF-κB信号通路以减轻神经炎症。核质分离显示，si-OTUD7B减少STAT3核转位，并降低Aβ诱导的STAT3与核转运蛋白KPNA3的结合。免疫荧光和Western blot显示，AAV-shOTUD7B或OTUD7B^CKO降低p65（NF-κB亚基）磷酸化和核转位。ChIP-qPCR显示，OTUD7B沉默减少STAT3与Tnf、Il1b、Il6启动子的结合。

3.8 OTUD7B增强STAT3依赖的Aβ诱导的小胶质细胞神经炎症。使用STAT3抑制剂Stattic处理OTUD7B^f/f和OTUD7B^CKO小鼠，发现Stattic可减轻Aβ诱导的神经元丢失、小胶质细胞激活、凋亡和炎症因子表达，但OTUD7B缺失未在Stattic基础上产生额外改善，表明OTUD7B的作用依赖于STAT3。

讨论部分总结：本研究首次鉴定OTUD7B为AD小胶质细胞炎症的关键调节因子。OTUD7B在AD模型和人脑数据库中上调，主要在神经元和小胶质细胞中表达，但功能分析表明其通过小胶质细胞而非神经元发挥促炎作用。机制上，OTUD7B通过去泛素化活性去除STAT3 K283处的K48连接泛素链，稳定STAT3，增强其核转位和下游炎症因子转录。OTUD7B-STAT3轴维持小胶质细胞驱动的神经炎症，OTUD7B是AD潜在治疗靶点。讨论还指出，目前OTUD7B特异性抑制剂有限，但2025年报道了首个抑制剂7Bi，仍需进一步优化。研究局限性包括：主要基于小鼠模型，需人源验证；仅使用雄性小鼠；OTUD7B可能还有其他底物；未全面评估Aβ斑块和Tau病理；新物体识别实验中辨别指数未达显著差异，需进一步验证。

研究结论翻译：本研究证明，OTUD7B通过去除K48连接泛素链增强STAT3信号，从而增加STAT3蛋白稳定性并调节小胶质细胞炎症反应。这些发现不仅增进了研究人员对去泛素化酶在小胶质细胞功能中机制作用的理解，而且为支持OTUD7B作为调节STAT3活性和干预神经炎症及阿尔茨海默病的潜在治疗靶点提供了实验证据。