VMAT-DAT-多巴胺调控系统在3-正丁基苯酞抗缺血性卒中保护作用中的参与

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：VMAT-DAT-Dopamine Regulatory System Involved in the Protective Effect of 3-n-Butylphthalide Against Ischemic Stroke

　　

目的：多巴胺的稳定摄取-释放循环系统依赖于两种转运体，即多巴胺转运体（DAT）和囊泡单胺转运体（VMAT）。尚不清楚多巴胺调控系统是否参与3-正丁基苯酞（NBP）介导的抗缺血性卒中损伤的神经保护作用。方法：研究人员采用大脑中动脉闭塞（MCAO）模型评估NBP的保护作用。在缺血半暗带区域进行在体微透析检测神经递质。制备MCAO小鼠的脑片，记录突触功能，包括微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）和微小抑制性突触后电流（mIPSCs）。结果：NBP以剂量依赖方式减少梗死面积，显著降低谷氨酸水平，同时明显增加多巴胺释放。MCAO显著降低DAT和VMAT的表达，而NBP则逆转增强其表达。使用VMAT抑制剂利血平预处理可消除NBP诱导的多巴胺增加，并消除其神经保护作用。缺血损伤破坏兴奋性与抑制性突触传递的平衡，而NBP可逆转这一失衡。利血平消除了NBP对mEPSCs和mIPSCs紊乱的调节作用。抑制多巴胺-1受体（D1R）或腺苷A1受体（A1R：D1R的下游）均消除了NBP对突触功能的调节，并取消了其神经保护作用。结论：NBP抗脑缺血损伤的神经保护作用可能涉及上调VMAT-DAT-多巴胺循环，这有助于改善突触功能障碍。D1R及其下游腺苷A1Rs的激活参与了该神经保护机制。

**论文解读：VMAT-DAT-多巴胺调控系统在3-正丁基苯酞抗缺血性卒中保护作用中的机制研究**

**研究背景与问题**
缺血性卒中在全球范围内是导致死亡和残疾的主要原因之一，每年影响约79.5万美国人，全球每年约700万人死亡，经济损失超过8900亿美元。目前，急性缺血性卒中的唯一有效治疗是组织型纤溶酶原激活剂（tPA）溶栓，但由于治疗时间窗狭窄（4.5小时内）和副作用，其应用受到极大限制。因此，深入理解缺血性损伤的生物学过程并开发新疗法至关重要。多巴胺是一种重要的儿茶酚胺类神经递质，参与运动控制、认知和情绪处理等多种行为过程。其稳定释放依赖于两种转运体：多巴胺转运体（DAT）和囊泡单胺转运体（VMAT），两者构成多巴胺的摄取-释放循环系统。已有研究表明，高水平多巴胺可能是缺血性卒中的保护因素，靶向DAT-多巴胺系统可能成为新策略。3-正丁基苯酞（NBP）最初从芹菜种子中提取，自2002年起在中国被批准为抗缺血性药物，具有显著的神经保护作用，包括减少梗死面积、抗氧化、抑制血小板聚集、改善血流和线粒体功能、抗血栓和抗炎等。然而，NBP的分子靶点研究尚不充分，其保护机制是否涉及多巴胺调控系统尚不清楚。为此，研究人员开展本研究，旨在探索NBP是否通过调节VMAT-DAT-多巴胺循环发挥抗缺血性卒中作用。

**研究内容与结论**
研究人员通过建立小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，结合在体微透析、全细胞膜片钳记录、免疫印迹和免疫组化等技术，系统评估了NBP对缺血性卒中损伤的保护作用及其机制。主要结论如下：（1）NBP以剂量依赖方式减少梗死面积，降低谷氨酸水平，同时增加多巴胺释放；（2）NBP逆转MCAO导致的DAT和VMAT表达下降；（3）使用VMAT抑制剂利血平消除多巴胺增加，并取消NBP的神经保护作用；（4）NBP恢复缺血损伤引起的兴奋/抑制性突触传递失衡；（5）多巴胺-1受体（D1R）和腺苷A1受体（A1R）参与NBP对突触功能的调节和神经保护。该研究揭示了NBP通过上调VMAT-DAT-多巴胺循环，激活D1R及其下游A1R，改善突触功能障碍，从而发挥抗缺血性卒中保护作用，为卒中治疗提供了新靶点。论文发表在《CNS Neuroscience》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用雄性ICR小鼠（20±2 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司）进行实验。主要方法包括：大脑中动脉闭塞（MCAO）模型制备，用于评估神经保护；在体微透析技术，在缺血半暗带海马CA1区检测细胞外多巴胺和谷氨酸浓度；全细胞电压钳记录技术，在脑片上记录微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）和微小抑制性突触后电流（mIPSCs）；免疫印迹（Western blotting）检测DAT、磷酸化DAT（P-DAT）、VMAT1和VMAT2蛋白表达；酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化染色评估多巴胺能神经元损伤。此外，使用VMAT抑制剂利血平、D1R拮抗剂SCH-23390和A1R拮抗剂PSB36进行药理学验证。

**研究结果**
3.1 NBP对小鼠缺血性脑损伤具有保护作用：通过MCAO模型，给予不同剂量NBP（40、80、160 mg/kg），TTC染色显示NBP以剂量依赖方式减少梗死面积（40 mg/kg组36.0%±7.55%，80 mg/kg组33.0%±8.19%，160 mg/kg组31.8%±7.69%，对照组44.1%±6.90%，p<0.05），神经功能评分虽有改善但未达统计学差异。

3.2 NBP调节MCAO小鼠多巴胺和谷氨酸的急性变化：在体微透析显示，MCAO后1小时谷氨酸升高约15倍（270±69.9 pg/μL），多巴胺升高约8倍（122±33.2 fg/μL）。NBP（80 mg/kg）显著降低1小时和6小时谷氨酸水平，并在6、24、72小时显著增加多巴胺水平（24小时：48.6±7.93 vs. 20.8±5.71 fg/μL，p<0.01）。

3.3 NBP不影响MCAO小鼠TH免疫组化阳性细胞丢失：TH染色显示，MCAO导致黑质和腹侧被盖区（VTA）多巴胺能神经元明显减少，但NBP治疗组与模型组无显著差异，表明NBP不直接保护多巴胺能细胞体。

3.4 NBP通过调节DAT和VMAT增加多巴胺：免疫印迹显示，MCAO后DAT、磷酸化DAT、VMAT1和VMAT2表达均显著下降，NBP（80 mg/kg）显著增强这些蛋白表达（DAT增加约26%，VMAT1增加41.4%，VMAT2增加39.8%，p<0.05或p<0.01）。

3.5 VMAT抑制剂利血平取消NBP的抗缺血性损伤保护：利血平预处理显著降低基础多巴胺水平，并消除NBP诱导的多巴胺增加。同时，利血平使NBP的梗死面积保护作用消失（NBP+利血平组38.7%±10.0% vs. 利血平组37.8%±7.90%，p>0.05），神经功能评分无差异。

3.6 NBP恢复MCAO小鼠缺血半暗带的突触功能：全细胞记录显示，MCAO后6小时和24小时mEPSC频率显著升高，mIPSC频率显著降低，表明兴奋/抑制（E/I）失衡。NBP显著降低mEPSC频率（6小时：8.13±2.90 Hz vs. 10.6±2.90 Hz，p<0.01）并增加mIPSC频率（6小时：6.01±1.15 Hz vs. 4.61±1.35 Hz，p<0.01），恢复E/I平衡。

3.7 利血平取消NBP对突触功能障碍的恢复作用：利血平预处理后，NBP对mEPSC和mIPSC频率的调节作用消失，两组间无显著差异。

3.8 D1R参与NBP对突触功能的恢复：D1R拮抗剂SCH-23390（1 μM）预处理脑片后，NBP不再改变mEPSC和mIPSC频率，表明D1R是NBP调节突触功能所必需的。

3.9 抑制A1R取消NBP的突触功能恢复和缺血性损伤保护：A1R拮抗剂PSB36（10 μM）预处理脑片后，NBP对mEPSC和mIPSC频率的调节作用消失。在体实验中，PSB36（0.5 mg/kg，腹腔注射）增加梗死面积（40.2%±9.23% vs. 32.3%±7.62%，p=0.06），并完全消除NBP的梗死面积减少和神经功能改善作用。微透析显示PSB36取消NBP降低谷氨酸的作用。

**总结与讨论**
讨论部分指出，NBP在急性缺血期通过VMAT和DAT增加多巴胺水平、降低谷氨酸浓度；多巴胺激活D1R，进而恢复突触功能平衡，产生神经保护作用；腺苷A1R作为D1R下游信号参与该过程。研究结果支持多巴胺水平与缺血性卒中的关系可能与其释放量和区域分布有关，且NBP通过上调VMAT-DAT-多巴胺循环发挥作用。值得注意的是，尽管DAT高表达可能减少突触间隙多巴胺，但VMAT功能恢复可增加多巴胺释放，重建高水平的循环平衡。此外，早期多巴胺升高可能源于快速功能调节（如转运体磷酸化状态、神经元放电改变等），而非蛋白丰度增加。讨论还指出，D1R激活通过PKA和A1R抑制兴奋性突触功能障碍，A1R激活减少Ca²⁺内流，抑制突触前功能和兴奋性神经递质释放，从而发挥神经保护作用。

**研究结论**
NBP抗脑缺血性损伤的神经保护作用可能至少部分涉及上调VMAT-DAT-多巴胺循环，这有助于改善突触功能障碍。D1R和腺苷A1Rs的激活似乎参与了下游信号级联反应。