综述：原位固定：邻近标记绘制不同细胞状态下的胶质细胞相互作用组

《GLIA》：Frozen in Place: Proximity Labeling Maps Glial Interactomes Across Cell States

　　

胶质细胞，包括放射状胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，是中枢神经系统（CNS）发育、稳态和疾病的活跃动态调节者。通过与神经元、其他胶质细胞群体以及血管系统的广泛相互作用，它们形成了高度专业化的通信网络，这对于正常脑功能至关重要。虽然转录组学方法揭示了广泛的胶质细胞异质性，并能够预测假定的信号网络，但一个关键挑战仍然是在不同胶质细胞类型内部和之间存在不同蛋白质复合物的水平上验证和转化这些发现。这主要是由于传统蛋白质组学技术缺乏空间分辨率和/或无法捕获蛋白质相互作用网络。邻近标记（PL）已成为克服这些限制的强大策略，通过实现具有空间和时间精度的细胞类型特异性蛋白质网络和亚细胞蛋白质组图谱绘制。新兴研究已应用PL酶，如BioID、TurboID和HRP，在多种胶质细胞群体中，开始揭示支持其与神经元和血管成分相互作用的蛋白质网络，从而允许代谢支持、微环境稳态维持和细胞间通讯（包括突触调节）。在这篇综述中，研究人员总结了主要的PL酶，讨论了不同胶质细胞类型的关键研究，并检查了应用PL研究胶质生物学所面临的技术挑战和未来前景。通过用空间分辨的蛋白质组学见解补充转录组数据，PL为加深研究人员对健康和疾病中胶质细胞生物学的理解提供了独特的机会。

论文主体部分总结如下：

**1 引言**

哺乳动物脑是一个高度复杂的器官，其功能依赖于多种细胞类型间的精确动态通信。传统上认为神经元是脑功能的主要驱动者，但占脑约50%的胶质细胞现被认为是神经回路形成、功能和稳态的积极贡献者。在中枢神经系统（CNS）内，胶质细胞可分为放射状胶质细胞（RGCs）、少突胶质细胞前体细胞（OPCs）、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。RGCs是胚胎前体细胞，最终产生OPCs、少突胶质细胞和星形胶质细胞，而小胶质细胞则源自卵黄囊前体细胞，在早期胚胎发生期间定植于CNS。这些胶质细胞群体与神经元、其他胶质细胞和血管系统进行广泛相互作用，在多个尺度上调节脑发育和功能。在发育过程中，RGCs还产生大多数神经元和胶质细胞，并提供引导神经元迁移的支架。OPCs不仅作为中间前体细胞，还与神经元和其他胶质细胞相互作用，接收多种神经元类型的输入，影响神经回路重塑，并分化为髓鞘形成少突胶质细胞。少突胶质细胞不仅髓鞘化轴突，还分泌因子被神经元摄取，支持轴突运输、能量稳态和应激抵抗。星形胶质细胞是哺乳动物脑中最丰富的胶质细胞类型，通过其终足参与血脑屏障（BBB）的形成和维持，并延伸出突触周围突起（PAPs）与突触紧密关联。小胶质细胞作为CNS的驻留免疫细胞，调节突触修剪、免疫监视和组织稳态。个体胶质细胞类型本身在脑区域间高度异质，表现为分子特征、形态、生理功能和对损伤/疾病的反应差异。过去十年，胶质细胞异质性在转录组水平上得到广泛研究，揭示了多个转录上不同的亚型。然而，转录组与蛋白质组之间存在显著差异，蛋白质经历翻译后修饰（PTMs），如磷酸化、泛素化和糖基化，这些修饰关键调节蛋白质活性、亚细胞定位和相互作用动态。传统的蛋白质相互作用研究方法，如免疫共沉淀（co-IP）和酵母双杂交（Y2H） assay，存在局限性，包括缺乏空间分辨率和无法捕捉瞬态相互作用。邻近标记（PL）通过在原代细胞和组织中选择性标记空间邻近的蛋白质，克服了这些限制，能够检测稳定和瞬态相互作用，并且可以与遗传策略结合实现细胞类型特异性表达。在胶质生物学中，PL已用于系统绘制塑造细胞身份、功能和与邻近细胞相互作用的蛋白质网络。

**2 使用生物素化酶的PL**

生物素化酶可分为两大类别：生物素连接酶和过氧化物酶。不同酶表现出不同的动力学、最佳温度、有效标记半径和氨基酸偏好，影响识别蛋白质集。尽管存在限制，PL方法具有明显优势，包括在苛刻裂解条件下高效回收膜相关蛋白和简单的链霉亲和素为基础的纯化。

**2.1 生物素连接酶**

基于生物素连接酶的PL依赖于工程化酶，如BioID、BioID2、microID、microID2、ultraID、TurboID、miniTurboID、AirID和BASU，这些酶催化生物素共价连接到邻近蛋白质的赖氨酸残基上。生物素连接酶利用ATP将生物素转化为反应中间体biotinoyl-5′-AMP，通常标记半径约10 nm，反应窗口从几分钟到几小时不等。BioID和BioID2在生理温度（~37°C）下工作，需要延长标记时间（6-24小时）以获取足够信号，适合检测稳定或持久的蛋白质网络。TurboID和miniTurboID通过工程化改造获得更高催化活性，在10分钟内实现稳健生物素化，适合研究瞬态相互作用。microID、microID2和ultraID进一步优化，ultraID结合快速动力学和高特异性，在几分钟内实现标记。AirID旨在减少细胞毒性和脱靶标记，BASU主要用于探测RNA-蛋白质邻近性。生物素连接酶的主要优势是与活细胞标记兼容，无需过氧化氢（H₂O₂），避免氧化应激，特别适合在天然非反应状态下探测胶质网络。

**2.2 过氧化物酶**

基于过氧化物酶的PL依赖辣根过氧化物酶（HRP）和抗坏血酸过氧化物酶（APEX）。这些酶使用H₂O₂氧化酚类化合物，生成高反应性苯氧自由基，主要与酪氨酸等富电子氨基酸残基反应。这些自由基半衰期极短，标记半径约20-50 nm，时间约1-10分钟，提供优越的时间分辨率。HRP适用于细胞表面蛋白质组和细胞外基质标记，但需要H₂O₂激活，可能引入氧化应激伪影。APEX2是改进版本，具有更高催化活性和更受限的标记半径（~20 nm），适用于亚细胞区室标记。APEX3进一步优化，实现更均衡的细胞质和细胞核分布。

**2.3 分裂变体**

分裂酶PL系统将酶（如HRP、APEX2、BioID、TurboID、AirID）分为两个催化无活性片段，仅在空间接近时恢复活性，提高空间选择性并降低非特异性标记。关键挑战在于催化效率通常低于全酶，可通过化学诱导二聚化或融合到细胞黏附蛋白来促进片段组装。总体而言，分裂酶PL以最大标记效率换取增强的特异性和背景控制。

**2.4 其他酶**

除生物素连接酶和过氧化物酶外，还有漆酶、泛素样连接酶、肽基和糖基基系统。漆酶（如LaccID）使用氧（O₂）作为电子受体，避免H₂O₂毒性，但标记半径尚未明确。泛素样连接酶（如PUP-IT、NEDDylator）完全由基因编码，要求直接酶-底物接触，提供高特异性但效率较低。肽基系统（Sortase A）和糖基系统（FucoID）分别依赖转肽反应和岩藻糖基转移酶介导的标记，具有接触特异性，但覆盖范围有限。这些系统尚未在胶质细胞中应用，但可能作为补充工具。

**3 PL在胶质细胞中的应用**

PL方法已应用于多种胶质细胞类型，但使用分布不均，星形胶质细胞研究最多。大多数研究采用生物素连接酶，标记主要集中在细胞内蛋白质组，仅少数研究进行细胞外标记。

**3.1 OPCs中的PL**

Hardt等（2023）使用BioID在NIH/3T3细胞中研究双皮质素样激酶1（DCLK1）在神经干细胞向OPCs分化中的作用，鉴定出DCLK1短亚型与核和增殖相关蛋白结合，长亚型与微管和细胞骨架成分结合，提示亚型切换调控细胞状态转变。

**3.2 少突胶质细胞中的PL**

Smirnova等（2023）使用TurboID在HEK293T细胞中鉴定髓鞘碱性蛋白（MBP）的潜在相互作用因子，共检测到297种蛋白，其中34种为MBP特有，涉及细胞黏附、囊泡运输和脂质代谢/铁死亡，但需在体内进一步验证。

**3.3 小胶质细胞中的PL**

Sunna等（2023）在BV2小胶质细胞中表达TurboID-NES，捕获了基础状态下的小胶质细胞蛋白质组，并检测到脂多糖（LPS）诱导的炎症反应中蛋白质组变化，包括干扰素应答和抗原呈递通路的上调。Bowen等（2024）将TurboID融合到钾通道Kv1.3，在BV2细胞中绘制其近端相互作用组，揭示Kv1.3在Toll样受体4（TLR4）激活后参与干扰素依赖性STAT1信号传导。

**3.4 RGCs中的PL**

D'Arcy等（2023）在胚胎小鼠皮层中使用体内BioID绘制放射状胶质细胞基底终足蛋白质组，发现非肌肉肌球蛋白MYH9和MYH10在终足分支和基底膜黏附中发挥非冗余功能，其缺失导致非细胞自主性神经元数量和定位缺陷。

**3.5 星形胶质细胞中的PL**

星形胶质细胞是PL研究最多的胶质细胞类型。Sun等（2022）使用AAV介导的TurboID在皮层星形胶质细胞中表达，鉴定出672种星形胶质细胞蛋白，包括经典标志物。Rayaprolu等（2022）生成Rosa26TurboID小鼠，结合Cre驱动子，获得925种星形胶质细胞富集蛋白，并揭示区域特异性特征。Soto等（2023）使用BioID2靶向纹状体星形胶质细胞的质膜、终足和精细突起，生成区室特异性蛋白质组，发现SAP90/PSD-95相关蛋白3（SAPAP3）调节肌动蛋白细胞骨架和抑制性突触稳定性，其缺失引发强迫症样行为。Hill等（2025）结合TurboID和血管分离，鉴定出2000多种终足蛋白，包括所有10种已知终足标志物。van Veen等（2026）通过LAMP1-TurboID确认ATP13A4在星形胶质细胞的内体/溶酶体定位。细胞外PL方面，Irala等（2024）将分泌型TurboID融合到神经蛋白（NCAN）C末端，鉴定出46种近端蛋白，揭示NCAN选择性调节生长抑素阳性（SST+）抑制性突触形成。Takano等（2020）使用分裂TurboID探测星形胶质细胞-神经元突触周围界面，鉴定出118种富集蛋白，包括神经元细胞黏附分子（NrCAM），其通过同源相互作用促进抑制性突触发生。Wu等（2025）使用HRP标记星形胶质细胞和神经元的细胞表面蛋白质组，共享561种蛋白，并发现亨廷顿病（HD）模型中该共享蛋白质组被破坏。Cooper等（2026）将TurboID融合到连接蛋白43（CX43）C末端，作为缝隙连接示踪剂，揭示星形胶质细胞网络在脑内具有区域特异性连接模式，从局部到长距离双侧网络。

**4 挑战与未来展望**

PL方法面临多重挑战。工具方面，过氧化物酶依赖外源H₂O₂，可能诱导氧化应激；生物素连接酶需要较长标记时间，降低时间特异性。PL报告空间邻近而非直接相互作用，需独立验证。分裂酶系统可提高特异性，但效率较低。技术瓶颈包括酶表达和定位的优化，以及从背景（如内源性生物素化蛋白）中区分真正近端相互作用。缺乏标准化生物信息学管道限制跨研究比较。时间分辨率不足，难以捕捉瞬态或动态事件。新兴光激活和钙依赖性策略（如PhoTag、Cal-ID）可能解决此问题。胶质生物学复杂性方面，需要细胞亚型特异性启动子或交叉策略以实现单细胞分辨率。尽管存在挑战，PL工具箱的快速扩展（如GlycoID）和重新利用（如追踪缝隙连接网络）表明其潜力，未来整合转录组学、空间蛋白质组学和电生理学将有助于将分子图谱转化为功能理解。