异丙噻醇烷破坏斑马鱼线粒体和内质网稳态并损害胚胎神经系统发育

《Journal of Hazardous Materials》：Isoprothiolane Disrupts Mitochondrial and Endoplasmic Reticulum Homeostasis and Impairs Development of the Embryonic Nervous System in Zebrafish

　　

摘要

异噻硫烷 (IPT) 是一种在亚洲水稻种植中广泛使用的杀菌剂，然而其毒理学特征仍未被完全阐明，特别是与职业环境相关的皮肤暴露方面。本研究使用人角质形成细胞 (HaCaT)、真皮成纤维细胞 (HDF) 和斑马鱼 (丹氏鱼) 胚胎，评估了 IPT 暴露的细胞毒性机制和发育后果。在人皮肤细胞中，IPT 产生了主要与严重线粒体功能障碍相关的细胞静止效应，包括膜去极化、氧化磷酸化受损以及备用呼吸能力几乎完全丧失。IPT 还诱导了内质网应激相关反应，证据包括 BiP 表达增加、eIF2α 磷酸化以及 ATF4 和 CHOP 的浓度依赖性诱导。在斑马鱼胚胎中，IPT 暴露导致浓度依赖性发育毒性，特征为心包水肿、心率降低、生长迟缓和眼部及脑部发育缺陷。毒理学评估表明颅部和视网膜区域有明显的活性氧 (ROS) 积累和凋亡信号增加，伴随血管生成和神经发育受损。N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 减弱了 ROS 积累以及血管和神经异常，支持氧化应激在这些发育效应中的促进作用。综上所述，这些发现揭示了人皮肤来源细胞中亚致死线粒体生物能量代谢损伤和内质网应激相关反应，以及斑马鱼中氧化应激相关的血管和神经发育异常，为 IPT 毒性提供了更广泛的理解。

引言

农药对现代农业至关重要，保护作物免受病原体侵害并提高生产力。然而，其广泛使用引起了对非目标生物的不利影响和环境污染的担忧 [1], [2]。因此，了解常用农药的毒理学特征对于评估人类健康风险至关重要，特别是对于有职业或环境暴露的人群。

异噻硫烷 (IPT) 是一种有机硫内吸性杀菌剂，开发于 20 世纪 70 年代，在亚洲水稻种植区广泛用于控制稻瘟病 (Magnaporthe oryzae) [3], [4]。环境归趋研究表明，IPT 在好氧土壤中具有中等持久性，但在淹水稻田典型的厌氧条件下表现出长期稳定性，增加了水生传播的潜力 [5], [6]。越南湄公河三角洲的田间监测研究在表层水中检测到 IPT，最大浓度分别为 8.49 和 11.24 μg/L [7], [8]。反映了这些环境担忧，IPT 被归类为世界卫生组织 II 类 (中等危害) 农药，并在包括日本在内的几个国家制定了饮用水指南 [9]。标准毒性研究已确定肝脏和肾脏为亚急性和慢性暴露后的主要靶器官，而水生研究报道了淡水鱼类的全身性效应和斑马鱼的心血管发育效应 [10], [11]。

除了全身毒性外，皮肤暴露在农药处理和应用过程中代表着关键的职业危害 [12]。与农药相关的皮肤病占所有职业病的 40% 以上，其中刺激性接触性皮炎和过敏性接触性皮炎占病例的 90-95% [13]。最新证据表明，农药可以在暴露的皮肤细胞中诱导氧化应激并破坏细胞稳态 [14], [15]。然而，IPT 在人皮肤来源细胞中诱导的亚致死细胞应激反应及其对神经发育的影响仍未得到充分表征。

为了填补这一空白，我们采用了一种整合人皮肤细胞测定与已建立脊椎动物发育模型的双重模型方法。人皮肤细胞提供了生理相关的系统来评估与皮肤相关的细胞机制，而斑马鱼 (Danio rerio)) 胚胎提供了一个互补的体内平台，用于评估水暴露条件下的发育危害潜力。丹氏鱼胚胎发育迅速且在体外进行，在受精后 96 小时内完成主要器官发生，其光学透明性使得能够实时可视化形态异常 [16]。此外，其保守的发育和应激反应通路使得能够评估化学诱导的跨多个发育过程的干扰 [17]。

本研究建立了一种整合的体外和体内方法，以评估 IPT 诱导的细胞应激反应和发育危害潜力。鉴于皮肤接触是农药处理期间的主要职业暴露途径，我们采用了一种逐步方法。首先，我们表征了人角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的细胞应激反应，包括线粒体生物能量代谢损伤、mtROS 积累和内质网应激。其次，我们使用丹氏鱼胚胎作为互补脊椎动物模型评估了 IPT 的发育效应。这些分析共同整合了人皮肤来源细胞中的细胞应激表征和斑马鱼中的发育评估，提供了对 IPT 毒性的更广泛表征。

章节摘要

试剂

异噻硫烷 (IPT, 50512-35-1) 购自 Sigma-Aldrich (美国)，并溶解于 DMSO 中制备 500 mM 储备液。所有实验组（包括溶剂对照组和 IPT 处理组）的最终 DMSO 浓度均保持在 0.103% (v/v)。溶剂对照组含有相同最终浓度的 DMSO，但不含 IPT。DMEM 和胰蛋白酶 -EDTA 购自 WELGENE。FBS 购自 Atlas Biologicals。PBS 购自 LONZA。青霉素 - 链霉素

IPT 对人皮肤细胞增殖和活力的影响

我们使用 HaCaT 和 HDF 作为正常皮肤的体外模型代表，研究了 IPT 的基础细胞毒性。我们首先使用台盼蓝排斥法进行了 24、48 和 72 小时的初步剂量反应评估。在暴露 72 小时后，细胞增殖的显著抑制变得尤为明显。基于这些数据，72 h 处理后的半最大生长抑制浓度 (GI₅₀) 计算为 HaCaT 细胞 91.36 μg/mL 和 116.5 μg/mL

讨论

本研究提出了对 IPT 诱导的细胞应激反应和发育危害潜力的整合体外和体内评估。在人皮肤来源细胞中，IPT 破坏了线粒体生物能量代谢并激活了内质网应激相关反应，而斑马鱼分析确定了氧化应激相关的血管和神经发育异常。这些发现共同提供了关于皮肤相关细胞功能障碍和脊椎动物的互补信息

结论

本研究表明 IPT 破坏了人皮肤来源细胞中的细胞稳态，并在斑马鱼中诱导了氧化应激相关的发育异常。备用呼吸能力的几乎完全丧失表明人角质形成细胞和真皮成纤维细胞中线粒体代谢适应性显著降低，伴随内质网应激相关信号传导。在斑马鱼中，NAC 介导的血管和神经异常减弱支持了氧化应激的作用

作者贡献

JYL 构思并设计了研究，建立了细胞培养方法，并监督了所有实验程序。SJL 收集了实验样本并进行了所有实验。SJL 和 JYL 分析并解释了数据，并为手稿的准备做出了贡献。所有作者都批判性地审查了手稿并批准了最终版本。

环境意义

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  异噻硫烷破坏了人皮肤细胞中的线粒体生物能量代谢和内质网稳态，揭示了一种以前未被充分认识的皮肤农药毒性机制。
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  暴露于农业杀菌剂可能引起超出局部皮肤效应的全身性发育毒性。
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  斑马鱼发育测定提供了一个有效的体内平台，用于识别农药暴露的神经血管和心脏危害。
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  这些发现支持为

CRediT 作者贡献声明

Sang-Jin Lee: 写作 – 原稿，可视化，验证，软件，资源，方法学，形式分析，数据管理。 Jin-Young Lee: 写作 – 原稿，监督，项目管理，资金获取，数据管理，概念化。

竞争利益声明

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会 (NRF- RS-2022-NR072089) 的支持。

利益声明

作者没有利益冲突需要声明。

Sang-Jin Lee|Jin-Young Lee

大韩民国大邱庆明大学自然科学学院生物科学系