《Cellular & Molecular Immunology》：Plakophilin 1 suppresses keratinocyte innate immune responses through DExD/H helicases
编辑推荐：
先天免疫应答是第一道防线，能对病原体及受损细胞释放的分子做出快速反应。它依赖于病原体感应受体，其中许多是核酸结合蛋白，包括RNA解旋酶。斑珠蛋白1（PKP1）是一种桥粒蛋白，对细胞间强粘附和上皮屏障完整性至关重要。PKP1的功能缺失突变导致外胚层发育不良-皮肤
先天免疫应答是第一道防线，能对病原体及受损细胞释放的分子做出快速反应。它依赖于病原体感应受体，其中许多是核酸结合蛋白，包括RNA解旋酶。斑珠蛋白1（PKP1）是一种桥粒蛋白，对细胞间强粘附和上皮屏障完整性至关重要。PKP1的功能缺失突变导致外胚层发育不良-皮肤脆性综合征（EDSFS），其特征为皮肤脆性、慢性炎症和反复感染。在此，研究人员报告PKP1（其在屏障形成中的作用是作为先天免疫应答的关键调节因子）隔离了一部分被DExD/H-box RNA解旋酶（DDX1、DDX3X、DDX21和DHX15）感应的双链RNA（dsRNA）。这限制了这些解旋酶激活MDA5-MAVS信号轴的能力，并防止了IRF3和NFκB驱动基因表达的过度激活，包括促炎细胞因子（主要是IFN-β1、IL6和TNFα）的合成。在先天免疫应答过程中，PKP1的抑制性作用被dsRNA信号消除，诱导蛋白酶体依赖性PKP1降解。这释放了被隔离的解旋酶，使得dsRNA感应和快速炎症反应成为可能。总之，这些发现将PKP1确定为在静息角质形成细胞中防止过度炎症的关键看门人，PKP1缺失后EDSFS中出现的过度炎症支持了这一观点。在具有促炎特性的健康角质形成细胞中，PKP1被快速降解，从而允许解旋酶激活MDA5-MAVS信号级联反应以启动炎症。因此，PKP1结合了表皮免疫稳态所必需的两种互补功能：它提供阻止物质进入的物理屏障，并抑制角质形成细胞中的先天免疫应答。
**研究背景与问题**
皮肤是人体最大的屏障器官，其物理屏障（由角质形成细胞通过桥粒紧密连接构成）与免疫屏障协同作用，抵御病原体入侵。桥粒蛋白不仅维持结构完整性，还参与免疫调控。斑珠蛋白1（PKP1）是复层上皮桥粒的关键组分，其缺失导致外胚层发育不良-皮肤脆性综合征（EDSFS），患者表现为皮肤脆性、慢性炎症和反复感染。然而，PKP1是否直接调控角质形成细胞的内在免疫应答，以及其分子机制尚不清楚。已有研究表明，PKP1与RNA结合蛋白相互作用，并在前列腺肿瘤中与免疫细胞募集相关，提示其可能超越结构功能，主动调节炎症。
**研究概述与结论**
本研究利用PKP1基因敲除（KO）小鼠和角质形成细胞模型，结合人类肺癌鳞状细胞癌（LUSC）转录组数据，发现PKP1是先天免疫应答的负调控因子。PKP1通过隔离DExD/H-box RNA解旋酶（DDX1、DDX3X、DDX21和DHX15），限制其激活MDA5-MAVS信号轴，从而抑制IRF3和NFκB驱动的促炎细胞因子（如IFN-β1、IL6、TNFα）的转录。在dsRNA刺激下，PKP1经蛋白酶体降解，释放解旋酶，启动炎症反应。该机制在维持皮肤免疫稳态中至关重要：PKP1缺失导致过度炎症，而PKP1高表达则与LUSC中MYC信号和免疫抑制性转录状态相关。论文发表在《Cellular》上。
**关键技术方法**
研究人员主要采用以下技术：1）小鼠模型：新生PKP1-KO小鼠及其野生型对照的皮肤蛋白提取物ELISA分析；2）细胞模型：自发永生化的野生型、PKP1-KO及PKP1-GFP回补小鼠角质形成细胞，以及人HaCaT细胞，通过siRNA敲低PKP1；3）刺激与检测：高分子量聚肌胞苷酸（pIC）转染模拟dsRNA，UVB照射，ELISA检测细胞因子，双荧光素酶报告基因测定NFκB和IRF转录因子活性，Western blot和免疫荧光分析信号蛋白磷酸化及核转位；4）蛋白互作：GFP-Trap免疫沉淀结合质谱（MS）鉴定PKP1结合蛋白，DuoLink邻近连接法（PLA）验证细胞内互作；5）转录组学：RNA-seq分析未刺激和pIC刺激的角质形成细胞，基因集富集分析（GSEA）比较WT、KO和回补细胞；6）临床数据：TCGA LUSC队列（550例）转录组数据，分析PKP1表达相关性。
**研究结果**
**Loss of PKP1 increases the secretion of proinflammatory cytokines in murine keratinocytes**
通过ELISA检测新生小鼠皮肤提取物，发现PKP1-KO小鼠的CXCL1、IL-1α和IL-6水平显著升高。在体外培养的角质形成细胞中，PKP1-KO细胞在基础条件下分泌更多的CXCL1和IL-1α；UVB照射或pIC转染后，PKP1-KO细胞分泌的CXCL1、IFN-β1、IL-1α、IL-6和TNFα均显著高于WT和回补细胞。在人HaCaT细胞中，PKP1敲低也增强了UVB和pIC诱导的IL6和TNFα分泌。RNA-seq和GSEA分析显示，PKP1-KO细胞中促炎基因集显著富集，且与LUSC中PKP1低表达肿瘤的炎症特征重叠。
**PKP1 affects the transcriptional control of proinflammatory cytokines**
双荧光素酶报告基因实验表明，PKP1-KO细胞中pIC诱导的NFκB和IRF反应元件活性显著高于WT和回补细胞。Western blot显示PKP1-KO细胞中IKKα/β磷酸化（S176/180）和IRF3磷酸化增强，但p65 S536磷酸化变化不明显；免疫荧光进一步证实PKP1-KO细胞中p65和IRF3的核转位增加。通过siRNA敲低p65或IRF3，发现p65主要调控TNFα分泌，IRF3主要调控IFN-β1和IL6分泌，两者共同驱动PKP1缺失后的过度炎症。
**PKP1 regulates MDA5/MAVS signaling to control the transcription of proinflammatory cytokines**
检测RLR通路蛋白，发现PKP1不影响MDA5、RIG-I、LGP2和MAVS的基础表达。在PKP1-KO细胞中敲低MDA5或MAVS显著降低pIC诱导的IRF3磷酸化、NFκB/IRF报告基因活性和细胞因子分泌；而RIG-I敲低无效，LGP2敲低仅部分减弱。这表明PKP1通过抑制MDA5/MAVS信号轴来限制炎症。
**PKP1-dependent transcriptional control of proinflammatory cytokines depends on DExD/H-box helicases**
质谱分析发现PKP1与DDX1、DDX3X、DDX21和DHX15四种DExD/H-box解旋酶结合，但不与MDA5、RIG-I或MAVS直接结合。免疫共沉淀和PLA实验证实了这些互作，且pIC刺激后互作减弱。在PKP1-KO细胞中敲低任一解旋酶均降低IRF3磷酸化、NFκB/IRF报告基因活性和细胞因子分泌，但效果弱于MDA5/MAVS敲低。说明这些解旋酶作为辅助因子促进MDA5/MAVS信号。
**Binding of PKP1 to DExD/H-box helicases is regulated by PKP1 stability**
非磷酸化突变体PKP1-4xA（主要定位于桥粒）无法结合这些解旋酶，也不能抑制NFκB/IRF活性及细胞因子分泌。pIC刺激导致PKP1蛋白水平时间依赖性下降，且蛋白酶体抑制剂MG132可阻止PKP1降解并增加IRF3磷酸化，表明PKP1降解是释放解旋酶激活信号的必需步骤。
**讨论与结论**
本研究揭示了PKP1的双重功能：通过桥粒维持物理屏障，并通过胞质中隔离DExD/H-box解旋酶抑制过度炎症。PKP1缺失导致MDA5/MAVS信号失控，引发EDSFS中的慢性炎症和感染。此外，在LUSC中PKP1高表达与MYC驱动的增殖和免疫抑制状态相关，提示其可能参与肿瘤免疫逃逸。研究结论：PKP1是整合上皮粘附与先天免疫应答的核心枢纽，其稳态缺失导致炎症放大，为理解炎性皮肤疾病和鳞状细胞癌提供了新机制。
