转录因子NFE2在急性髓系白血病氧化还原调控和化疗耐药中的新作用

《Leukemia》：A novel role for transcription factor NFE2 in redox regulation and chemotherapy resistance in acute myeloid leukemia

　　

转录因子NFE2的活性升高足以在缺乏经典白血病驱动因素的情况下引起白血病转化。然而，促进NFE2驱动白血病发生的分子机制尚不清楚。研究人员在此报道了NFE2作为白血病细胞氧化应激反应关键调节因子的一个先前未被识别的作用。通过对NFE2基因组占据及其对染色质可及性和转录影响的综合分析，研究人员证明NFE2调节谷胱甘肽（GSH）稳态以及中心解毒酶的表达。在氧化还原应激下，NFE2构成了MLL-AF9转化的原代白血病细胞中评分最高的基因依赖性之一，显著高于普遍认可的氧化还原调节因子NRF2（NFE2相关因子2）。因此，NFE2敲低使白血病细胞对GSH耗竭、铁死亡诱导以及阿糖胞苷（cytarabine）治疗更敏感。通过推导一个NFE2 RedOx评分，研究人员证明NFE2活性升高构成了急性髓系白血病（AML）患者诊断时预后不良的独立预测因素。

**论文解读：转录因子NFE2在急性髓系白血病氧化还原调控和化疗耐药中的新作用**

**研究背景与问题**
急性髓系白血病（AML）中转录因子NFE2的表达升高，且部分骨髓增殖性肿瘤（MPN）和AML患者携带增强NFE2活性的突变。在多种小鼠模型中，NFE2水平升高足以在缺乏经典AML驱动因子时诱发急性白血病，且携带NFE2突变的MPN患者白血病转化风险增加10倍，总生存期显著缩短。然而，NFE2驱动白血病发生的分子机制此前未知。既往研究主要将NFE2视为红系和巨核系转录因子，其在这些谱系外的功能未被充分表征。同时，AML细胞对氧化应激的抵抗增强在疾病起始和持续中起重要作用，此前这一特性被归因于NRF2（NFE2相关因子2）活性升高。NFE2与NRF2同属Cap’n’collar（CnC）转录因子家族，但NFE2是否参与氧化还原调控尚不明确。因此，研究人员开展本研究，旨在阐明NFE2在AML氧化还原调控和化疗耐药中的新作用。

**研究概述与结论**
研究人员通过整合ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq等多组学分析，发现NFE2直接结合并调控经典NRF2靶基因，包括谷胱甘肽（GSH）合成限速酶GCLM、胱氨酸/谷氨酸转运体SLC7A11等。NFE2与NRF2在大多数结合位点共定位，并协同促进染色质可及性和基因表达，而非此前假设的拮抗作用。NFE2是MLL-AF9转化原代白血病细胞在氧化应激下最重要的基因依赖性之一，其重要性超过NRF2。NFE2敲低导致GSH水平下降、活性氧（ROS）升高，并增强细胞对铁死亡诱导剂（如ML-210）和化疗药物（如阿糖胞苷）的敏感性。基于NFE2调控的氧化还原相关靶基因，研究人员构建了NFE2 RedOx评分，该评分在五个独立AML队列中均能独立预测患者总生存期缩短。该研究发表于《Leukemia》。

**关键技术方法**
研究人员使用CB3细胞（天然缺乏NFE2活性）进行NFE2过表达或与NRF2共表达，结合ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）、ATAC-seq（转座酶可及染色质测序）和RNA-seq分析转录组及染色质变化。通过MLL-AF9转化鼠原代造血干细胞和祖细胞（HSPCs），进行全基因组CRISPR-Cas9文库筛选（含92,919个sgRNA），在H₂O₂诱导的氧化应激下鉴定NFE2依赖性。利用shRNA敲低NFE2，检测GSH水平、ROS水平、铁死亡及化疗敏感性。临床验证基于BEAT AML、TCGA LAML、TARGET AML、Verhaak等和Jayavelu等公开队列共446例初诊AML患者样本。

**研究结果**
- **NFE2过表达对转录组的影响**：在CB3细胞中，活性NFE2（野生型或K287R突变体）与无活性NFE2（R273W或Del297-300突变体）相比，差异表达基因2841个，包括已知NFE2靶基因（如血红蛋白β、Gata2、血小板因子4）及意外富集的“活性氧物种通路”基因集（GSEA分析）。
- **NFE2诱导经典NRF2靶基因表达**：NFE2过表达上调了七个NRF2相关基因集（包括Conrad等和Goldstein等报道的NRF2特征基因），提示NFE2与NRF2共同调控抗氧化基因。
- **NFE2直接结合并反式激活抗氧化基因**：ChIP-seq鉴定8500个高置信度NFE2结合峰，ATAC-seq显示NFE2表达后4329个位点染色质可及性增加，且多数位点被NFE2结合。NFE2结合位点富集NRF2、CnC家族及AP1、Maf识别元件（MARE）基序。以Gclm位点为例，NFE2结合后染色质可及性和RNA表达均升高。
- **NFE2与NRF2共享大部分结合位点**：在K562细胞中，NFE2和NRF2的ChIP-seq数据显著共定位（p<10^-10），共享相同核心结合基序。
- **NFE2与NRF2协同改变染色质可及性**：在CB3细胞中分别或共表达NFE2和NRF2，多数差异可及区域（4015个）在两者共表达时染色质可及性更高，提示协同作用。Gclm位点显示共表达时ATAC信号最强。
- **NFE2与NRF2靶基因形成不同表达簇**：无监督聚类将差异表达且被ChIP-seq结合的基因分为6个簇。簇2（红色）包含经典NFE2靶基因（如血红蛋白β、血小板因子4），NRF2可辅助其表达；簇3（紫色）包含应激反应基因（如Gclm、Nqo1），NFE2单独即可上调，共表达时表达更高，反驳了此前拮抗模型。
- **NFE2是GSH稳态的关键调节因子**：NFE2或NRF2单独表达均增加CB3细胞GSH水平，共表达时进一步升高；HL-60细胞中NFE2敲低降低GSH水平及抗氧化基因（GCLM、SLC7A11、OSGIN1）的表达，并增强对H₂O₂的敏感性。NFE2过表达降低细胞内ROS水平。
- **NFE2是MLL-AF9转化原代细胞中氧化还原特异性基因依赖性**：CRISPR筛选显示，在H₂O₂应激下，Nfe2缺失的sgRNA显著耗竭，且重要性高于Nrf2，表明NFE2是氧化应激下最关键依赖基因。
- **NFE2缺陷使AML细胞对铁死亡更敏感**：HL-60和HEL细胞中NFE2敲低后，对铁死亡诱导剂ML-210的细胞死亡比例显著增加，该效应可被铁死亡抑制剂ferrostatin逆转；对GSH耗竭剂parthenolide的敏感性也增强。
- **NFE2缺陷使AML细胞对化疗药物更敏感**：NFE2敲低的HL-60和HEL细胞对阿糖胞苷（Ara-C）的IC₅₀显著降低；HEL细胞对柔红霉素敏感性也增加。
- **NFE2 RedOx评分预测AML患者不良生存**：基于簇3中251个NFE2靶基因，在BEAT AML队列中构建20基因NFE2 RedOx评分。高评分患者总生存期显著缩短（p<0.001），且独立于年龄、ELN风险分组、白细胞计数等临床因素。该评分在TCGA LAML、Verhaak等、TARGET AML、Jayavelu等四个独立验证队列中均显著预测不良预后。

**总结与讨论**
本研究首次揭示NFE2在AML细胞中作为氧化应激反应关键调节因子的新角色。NFE2通过直接结合并上调GSH合成酶（GCLM）、胱氨酸转运体（SLC7A11）及解毒酶（GPX4）等靶基因，与NRF2协同维持GSH稳态、降低ROS水平，从而保护细胞免受氧化应激和铁死亡。NFE2敲低通过削弱上述机制，使AML细胞对铁死亡诱导和化疗药物（阿糖胞苷）更敏感。临床数据表明，NFE2 RedOx评分升高提示患者预后不良，靶向NFE2活性可能逆转AML细胞的氧化还原适应性，增强化疗敏感性，诱导更深缓解。研究结论：NFE2是AML氧化还原调控和化疗耐药的新型决定因子，其活性升高通过促进GSH合成、增强解毒酶表达及防止铁死亡等协同机制赋予AML细胞生存优势，NFE2 RedOx评分可作为独立预后标志物，降低NFE2活性可能为AML治疗提供新策略。