非瑟酮减轻淀粉样蛋白-β诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞神经毒性：整合计算机靶点预测与体外验证

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Fisetin Attenuates Amyloid-Beta-Induced Neurotoxicity in Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells: Integrating In Silico Target Prediction and In Vitro Validation

　　

淀粉样蛋白-β（Aβ）和tau缠结在大脑中的积累导致阿尔茨海默病（AD）。非瑟酮是一种天然黄酮类化合物，是一种抗氧化分子，但其神经保护作用尚不清楚。因此，研究人员尝试利用计算机模拟方法和Aβ_1-42诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞神经毒性模型评估非瑟酮的神经保护作用。计算机模拟研究表明，非瑟酮与多种蛋白质（如ULK1（自噬标志物）、p21（衰老/细胞周期标志物）和突触素（突触标志物））具有强且高稳定性的结合，这些蛋白质负责维持大脑健康并与AD相关。此外，还发现Aβ_1-42能与这些蛋白质靶点结合，表明Aβ_1-42和非瑟酮均靶向共同的结合位点。对SH-SY5Y细胞的体外研究进一步证实，非瑟酮在Aβ_1-42的毒性作用下促进细胞存活。它降低了氧化应激，并恢复了被Aβ_1-42处理损伤的离子通道活性。非瑟酮增强了抗氧化防御，并恢复了控制脑信号的分子活性。总之，非瑟酮通过减少氧化损伤、支持离子通道活性和诱导自噬过程，作用于多个靶点保护神经元。

阿尔茨海默病（AD）由淀粉样蛋白-β（Aβ）肽积累形成老年斑和tau蛋白过度磷酸化聚集形成神经原纤维缠结（NFTs）引起。Aβ病理通常先于tau变化，破坏突触功能，导致神经元丢失和脑萎缩，机制涉及兴奋性毒性、突触功能障碍和氧化应激。自噬是清除受损蛋白和细胞器的重要过程，随年龄增长而下降，在AD中导致蛋白聚集。mTOR通路（尤其是mTORC1）调控自噬，非瑟酮作为自噬诱导剂可调节PI3K/AKT/mTOR信号通路。非瑟酮是一种生物活性黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和促自噬作用，可改善认知缺陷，但机制尚不完全清楚。现有研究多集中于短Aβ肽（如Aβ_25-35），对Aβ_1-42的研究有限，且非瑟酮抑制Aβ纤维形成的作用机制报道不足。因此，研究人员开展本研究，利用计算机模拟方法考察非瑟酮与自噬标志物、突触标志物、胆碱能酶和离子通道的相互作用，并通过体外实验验证非瑟酮对Aβ_1-42中毒的SH-SY5Y细胞的影响，评估氧化应激、离子通道功能及关键自噬和突触标志物的基因表达，以建立计算机模拟与体外发现之间的联系。该研究发表于《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》。

主要关键技术方法：1. 计算机模拟：使用Schr?dinger Maestro 14.0.134进行分子对接（Glide XP模式）、蛋白质-蛋白质对接（PIPER）、结合自由能计算（Prime MM-GBSA）和分子动力学模拟（Desmond，200 ns），采用OPLS4力场和VSGB 2.1溶剂化模型；ADMETlab 3.0预测药代动力学和安全性。2. 体外实验：人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y（购自ATCC）经维甲酸和脑源性神经营养因子（BDNF）诱导分化后，分为对照组、非瑟酮组、Aβ_1-42组和联合处理组；MTT法检测细胞活力；比色法测定Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性；荧光法和分光光度法检测活性氧（ROS）、脂质过氧化（LPO，以丙二醛MDA表示）和蛋白羰基（PCO）水平；测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）水平；实时定量PCR（qPCR）检测自噬、衰老、突触相关基因mRNA表达，以β-肌动蛋白为内参。

研究结果：
3.1 分子对接分析：通过分子对接和MM-GBSA计算，非瑟酮与ULK1（自噬标志物）、p21（衰老/细胞周期标志物）和突触素（突触标志物）表现出强结合亲和力，对接分数分别为-8.49、-5.96和-5.89 kcal/mol，结合自由能分别为-33.26、-30.69和-31.59 kcal/mol；Aβ_1-42与这些蛋白的蛋白质-蛋白质对接也显示有利的PIPER分数，表明两者共享共同结合位点。
3.2 分子动力学模拟：200 ns模拟显示，非瑟酮与ULK1、p21和突触素的复合物均保持稳定，RMSD和RMSF分析表明结构完整性，蛋白质二级结构元素（SSE）维持，关键残基（如ULK1的ASP99、TYR93）形成持久接触。
3.3 药物特性分析：ADMET分析显示非瑟酮具有高代谢稳定性和低预测毒性，但肠道渗透性差（Caco-2和MDCK通透性低），血浆蛋白结合率高（95.3%），血脑屏障穿透性差，强抑制CYP1A2、CYP3A4和CYP2C8，半衰期短（1.732 h），符合Lipinski五规则，提示需优化吸收和代谢交互。
3.4 非瑟酮和Aβ_1-42对细胞活力的影响：MTT检测显示，Aβ_1-42剂量依赖性降低SH-SY5Y细胞活力（2.0 μM时降至45%），非瑟酮25 μM单独处理使活力升至122%，而更高浓度（50–200 μM）降低活力；联合处理组（1.5 μM Aβ_1-42 + 25 μM非瑟酮）显著恢复细胞活力，表明非瑟酮保护神经元免受Aβ毒性。
3.5 非瑟酮维持Na⁺/K⁺-ATP酶活性：Aβ_1-42处理将Na⁺/K⁺-ATP酶活性从对照组232降至112 μmol Pi/mg蛋白/h，非瑟酮联合处理恢复至221，接近对照组，表明非瑟酮逆转Aβ诱导的离子泵抑制。
3.6 Ca²⁺-ATP酶活性：Aβ_1-42使Ca²⁺-ATP酶活性从343降至183 nmol Pi/mg蛋白/min，非瑟酮联合处理恢复至320，表明非瑟酮保护钙离子稳态。
3.7 非瑟酮缓解促氧化参数：Aβ_1-42组ROS水平升至对照组的172%，MDA升至4.7 nmol/mg蛋白，PCO升至5.1 nmol/mg蛋白；非瑟酮联合处理显著降低这些指标至116%、2.6和3.0，接近对照组，表明非瑟酮减轻氧化损伤。
3.8 非瑟酮恢复抗氧化水平：Aβ_1-42显著降低SOD（6.8 vs 17.2 U/mg蛋白）、CAT（5.1 vs 11.2 μmol H₂O₂/min/mg蛋白）和GSH（14 vs 25 μmol/mg蛋白）；非瑟酮联合处理恢复至15.4、10.0和21，表明非瑟酮增强抗氧化防御。
3.9 自噬、衰老和突触标志物基因表达分析：qPCR显示，Aβ_1-42下调自噬基因ULK1和Beclin1（1.44和1.07倍），上调衰老基因p21和p16（2.23和1.88倍），下调突触基因synapsin1、PSD95和synaptophysin（0.33、0.574和0.412倍），并降低Sirtuin1和Keap1表达；非瑟酮单独或联合处理显著上调ULK1（8.7倍）、Beclin1（6.34倍）、p62（1.72倍）、Sirtuin1（5.43倍）、Keap1（1.21倍）及突触基因，下调p21和p16至接近或低于对照组，表明非瑟酮促进自噬、抑制衰老、维持突触完整性。

讨论部分总结：非瑟酮通过结合ULK1、p21和突触素等靶点，调节自噬启动、衰老通路和突触功能，在Aβ_1-42}暴露的SH-SY5Y细胞中发挥神经保护作用。非瑟酮恢复Na⁺/K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶活性，维护离子稳态；降低ROS、LPO和PCO，升高SOD、CAT和GSH，减轻氧化应激；上调自噬相关基因（ULK1、Beclin1、p62）和Sirtuin1、Keap1，下调衰老标志物p21和p16，并恢复突触蛋白（synapsin1、PSD95、synaptophysin）表达。ADMET分析显示非瑟酮具有良好代谢稳定性和低毒性，但吸收差和CYP抑制风险需优化。这些发现强调了非瑟酮作为AD潜在治疗药物的多靶点机制。

研究结论：计算机模拟研究揭示了非瑟酮与参与AD病理的关键神经元受体和蛋白（包括ULK1、p21和突触素）的稳定结合。此外，ADMET分析显示了有利的药代动力学和安全性特征，尽管存在吸收和潜在药物相互作用风险方面的某些限制。本研究进一步证明，非瑟酮通过维持离子转运蛋白功能、减少氧化应激以及维持与自噬、衰老、神经和突触标志物相关基因的表达，对Aβ_1-42诱导的神经毒性具有显著的神经保护作用。