松果体对于斑马鱼幼体细菌感染的最佳夜间免疫是必需的

《Journal of Pineal Research》：The Pineal Gland Is Required for Optimal Nighttime Immunity to Bacterial Infection in Larval Zebrafish

　　

细菌感染的免疫反应表现出昼夜节律性（circadian rhythmicity），在白天通常观察到增强的抗菌免疫（antibacterial immunity）。这种受昼夜节律门控的免疫反应被认为进化而来，以将峰值抗菌免疫与活动时增加的感染威胁同步。研究人员之前使用斑马鱼幼体感染模型已经表明，光照对抗菌免疫有积极影响，在光照期进行感染时观察到存活率提高和中性粒细胞（neutrophil）募集增强。然而，光感受性松果体（pineal gland）及其主要激素褪黑素（melatonin）对这一昼夜节律免疫反应的具体贡献尚未被研究。在此，研究人员通过靶向消融松果体，检验了松果体是否以一天中的时间依赖性方式调节宿主对细菌感染的反应。为了产生松果体缺陷幼体，研究人员创建了转基因斑马鱼品系Tg(exorh:YFP-NTR2.0)，该品系将高效硝基还原酶变异体NTR2.0（nitroreductase variant NTR2.0）的表达限制在松果体细胞（pinealocytes），从而实现甲硝唑（metronidazole）介导的松果体切除术（pinealectomy）。研究人员还分析了缺乏脑特异性同源框（brain-specific homeobox, bsx）基因的幼体，该基因编码松果体发育所必需的转录因子。两种方法均导致松果体完全缺失，通过活体成像、芳基烷基胺N-乙酰转移酶2（arylalkylamine N-acetyltransferase 2, aanat2）表达缺失以及褪黑素产生减少得以证实。松果体缺陷幼体在光照期感染时表现出正常的存活率和中性粒细胞募集，表明日间免疫防御可以在不依赖松果体的情况下维持。相反，在暗期感染松果体缺陷幼体导致存活率显著降低，这与感染部位中性粒细胞募集受损相关。这些发现表明松果体在支持斑马鱼幼体夜间抗菌免疫中发挥重要作用。

**研究背景、问题及研究意义**
细菌感染引发的宿主免疫反应呈现昼夜节律性（circadian rhythmicity），通常在活动期（白天）达到抗菌免疫（antibacterial immunity）高峰，这一现象被认为进化上有利于同步增强防御与感染风险。前期研究在斑马鱼（zebrafish）幼体模型中发现，光照对抗菌免疫具有正向调节作用，能提升感染后存活率并促进中性粒细胞（neutrophil）募集。然而，光感受器——松果体（pineal gland）及其主要激素褪黑素（melatonin）是否直接参与这一昼夜节律性免疫应答，尚不清楚。为阐明松果体在时间依赖性宿主防御中的角色，研究人员利用斑马鱼幼体这一兼具透明性、保守先天免疫系统及昼夜节律调节机制的模型，通过两种独立方法获得松果体缺陷幼体，在不同光照条件下系统评估了细菌感染后的存活率与中性粒细胞募集动态。该研究揭示了松果体在夜间抗菌免疫中的关键支持作用，为理解昼夜节律与免疫互作提供了新视角，并可能为感染性疾病的时间治疗策略提供依据。论文发表在《Journal of Pineal Research》。

**关键技术方法**
研究人员采用两种互补策略产生松果体缺陷幼体：（1）转基因品系Tg(exorh:YFP-NTR2.0) 利用高效硝基还原酶变异体NTR2.0，结合低剂量甲硝唑（metronidazole, MTZ, 100 μM）特异性消融松果体感光细胞；（2）通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除脑特异性同源框（bsx）基因，该基因编码松果体发育必需转录因子，从而获得bsx crispants（F0代突变体）。松果体缺失通过活体荧光显微镜确认，并辅以原位杂交检测aanat2（芳基烷基胺N-乙酰转移酶2）表达缺失及ELISA法测定褪黑素水平降低来验证。感染实验采用后脑室注射表达绿色荧光蛋白的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium, Sal-GFP）1000 CFU，在52 hpf（受精后小时）时于不同光照相（LD或DL条件）进行。样本均来自奥克兰大学斑马鱼设施。

**研究结果**
**3.1 Tg(exorh:YFP-NTR2.0)幼体以极低剂量甲硝唑实现松果体感光细胞消融**
研究人员通过松果体特异性exorh启动子驱动YFP-NTR2.0表达，建立转基因品系。经不同浓度MTZ（1–300 μM）处理，发现100 μM MTZ即可完全消除YFP标记的松果体细胞，而DMSO对照或Tg(exorh:EGFP)对照组均保留信号。
**3.2 甲硝唑处理的Tg(exorh:YFP-NTR2.0)幼体不表达aanat2且褪黑素产生受抑制**
在DL条件下（暗期ZT16），DMSO处理的对照幼体松果体高表达aanat2，而100 μM MTZ处理的转基因幼体完全缺失aanat2信号；同时，ELISA检测显示褪黑素水平低于检测限（对照为17.0±2.5 pg/mL），证实了松果体功能丧失。
**3.3 bsx crispants缺乏功能性松果体**
通过NGS测序确认bsx sgRNA1的编辑效率达83.59%，活体成像显示bsx crispants中EGFP标记的松果体消失，且aanat2表达在DL条件暗期完全缺失，与MTZ消融表型一致。
**3.4 松果体在暗期感染时促进中性粒细胞募集与存活**
在LD条件（光照期ZT4）感染后，MTZ消融或bsx敲除的松果体缺陷幼体与对照相比，存活率及感染部位中性粒细胞数量均无显著差异。但在DL条件（暗期ZT16）感染时，松果体缺陷幼体存活率显著降低（MTZ组降低16.5%，bsx crispant组降低18.3–19.0%），且中性粒细胞募集减少（MTZ组减少56.4%，bsx crispant组减少60.0–63.5%）。表明松果体对夜间而非日间抗菌免疫至关重要。

**总结讨论与研究结论**
讨论部分指出，褪黑素可通过G蛋白偶联受体MT1/MT2调节免疫，且已知能促进啮齿类及人类中性粒细胞趋化。在斑马鱼无菌损伤模型中，外源褪黑素可增强中性粒细胞募集，而内源性褪黑素（依赖aanat2）是节律性募集的必要条件。本研究首次在感染背景下证明松果体直接参与夜间宿主防御，且日间免疫可独立于松果体维持。此外，新建立的Tg(exorh:YFP-NTR2.0)品系利用NTR2.0变体，较传统NTR系统（需10 mM MTZ）效率提升百倍，可实现持续低剂量消融，为松果体研究提供了有力工具。最终研究结论（原文翻译）：这些发现表明松果体在支持斑马鱼幼体夜间抗菌免疫中发挥重要作用。