四个二倍体野生花生种（Arachis duranensis、A. stenosperma、A. magna 和 A. batizocoi）中改良的同源四倍体诱导方法

《Plant Breeding》：Improved Autotetraploid Induction Methods in Four Diploid Wild Peanut Species: Arachis duranensis, A. stenosperma, A. magna, and A. batizocoi

　　

花生（Arachis hypogaea L.，2n=4x=40，AABB）是全球重要的豆科作物。野生花生（Arachis spp.）是具有多样抗病性的宝贵次级基因库。然而，大多数野生花生种是二倍体（2n=2x=20），这种倍性障碍是杂交和基因渗入的主要障碍。研究人员已利用倍性操作克服此问题，但需要快速、高效的染色体加倍方法以促进基因渗入。研究人员先前报道的秋水仙素缓冲液浸没法成功诱导了二倍体花生的四倍体。然而，诱导效率低且幼苗死亡率高。本研究评估了四种改良的秋水仙素-缓冲液-浸没方法，包括三种基于基质的和一种半悬浮秋水仙素施用方法。研究使用了四种野生花生种的预萌发种子：A. duranensis（A-基因组）、A. stenosperma（A-基因组）、A. magna（B-基因组）和A. batizocoi（K-基因组）。为获得最佳结果，进一步调整了A. magna的处理时间和A. stenosperma的秋水仙素浓度。通过流式细胞术（flow cytometry）验证了存活处理植株的倍性。在各物种的最佳处理下，存活幼苗中A. batizocoi、A. duranensis、A. magna和A. stenosperma的最高四倍体转化率分别为57%、14%、60%和50%。气孔大小和密度结果显示，所有二倍体都比四倍体具有更小的气孔和更高的气孔密度。这些结果为野生花生种的染色体加倍提供了改良方案，并将促进未来花生育种中的基因渗入。

**论文解读：改良的同源四倍体诱导方法在四种二倍体野生花生种中的应用**

**研究背景与问题**

花生（Arachis hypogaea L.，2n=4x=40，AABB）作为一种全球重要的油料作物，其遗传多样性因单一起源和长期选择育种而显著降低，经历了遗传瓶颈。为打破这一瓶颈，育种家关注野生花生（Arachis spp.）这一具有丰富遗传多样性的次级基因库。野生花生中许多物种为二倍体（2n=2x=20），而栽培花生为四倍体，倍性障碍成为杂交和基因渗入的主要障碍。倍性操作（如人工诱导染色体加倍）是克服这一障碍的关键手段，但现有方法存在诱导效率低、幼苗死亡率高的问题。此前研究人员报道的秋水仙素缓冲液浸没法虽能诱导四倍体，但存活率极低，即使在水处理对照组中也如此。因此，需要开发更高效、可靠的染色体加倍方案，以促进来自不同亚基因组（A、B、K-基因组）野生花生的抗病、抗虫等优良性状向栽培花生的渗入。

**主要技术方法**

本研究采用四种改良的秋水仙素（colchicine）施用方法处理预萌发的种子：三种基于基质（泥炭藓、纸巾、珍珠岩）的处理和一种半悬浮处理。种子来自美国北卡罗来纳州立大学花生育种与遗传学项目的四种野生花生种——A. duranensis（A-基因组，PI 468321）、A. stenosperma（A-基因组，PI 338280）、A. magna（B-基因组，PI 468337 和 PI 599183）和A. batizocoi（K-基因组，PI 468325）。通过流式细胞术（flow cytometry）鉴定存活植株的倍性，并测量气孔大小和密度以辅助验证。统计分析使用二项广义线性模型和Fisher精确检验。

**研究结果**

**实验1：四种野生花生种中不同处理方法的测试**
通过对比三种基质处理（泥炭藓、纸巾、珍珠岩）和半悬浮处理（5 mM秋水仙素，6小时），发现半悬浮处理在A. duranensis和A. magna中获得了最高的转化率（分别为14%和11%），而A. batizocoi在泥炭藓处理下转化率最高（57%）。A. stenosperma在所有处理中仅获得一个混倍体，未获得四倍体。总体存活率范围为0%至77%，推测与温室环境条件及种子强休眠性有关。

**实验2：A. magna的半悬浮处理时间测试**
针对A. magna（PI 599183）测试了6、12、24小时半悬浮处理，发现12小时处理获得最高转化率（60%），而6小时仅为6%，24小时处理无存活植株。该结果说明处理时间显著影响四倍体转化效率。

**实验3：A. stenosperma的秋水仙素浓度测试**
对A. stenosperma进行1.25、2.5、5 mM秋水仙素半悬浮处理12小时，结果显示5 mM处理获得50%转化率（3株四倍体），2.5 mM处理同样为50%，1.25 mM为14%，但各处理间差异未达统计学显著水平。由于种子休眠和数量有限，每组仅使用10颗萌发种子。

**气孔形态比较**
四倍体植株的气孔宽度和长度均显著大于二倍体，而气孔密度显著降低（除A. batizocoi密度差异不显著外）。该结果可作为流式细胞术无法使用时快速鉴别倍性的辅助指标。

**总结与结论**

讨论部分指出，半悬浮处理通过优化秋水仙素与种子的接触并减少缺氧风险，是提高四倍体诱导效率的有效策略。基质处理虽存活率稍高，但转化率较低。研究还发现，在野生花生中，四倍体转化率在存活率较低（15%–30%）时达到峰值，这可能表明需要较强的秋水仙素胁迫（LD85至LD70）才能有效诱导染色体加倍。该研究为A、B、K-基因组野生花生种建立了高效、可靠的同源四倍体诱导方案，为后续通过合成四倍体杂交或直接杂交将野生种优良性状渗入栽培花生提供了关键育种材料。

**结论翻译**：在本研究中，研究人员开发了一种改良的半悬浮方法，以高效诱导A、B和K基因组内的野生花生种的同源四倍体。研究人员还调整了各物种的秋水仙素处理时间和浓度以提高诱导效率。研究结果进一步表明，野生花生种的有效四倍体诱导可能需要相对较高的秋水仙素胁迫，导致低至中等存活率（15%–30%），这对应于最佳的四倍体转化效率。