肥胖中高凝状态的肝脏机制与治疗靶点：来自遗传学和转录组学分析的见解

《Exploration》：Hepatic Mechanisms and Therapeutic Target Underpinning Hypercoagulation in Obesity: Insights From Genetic and Transcriptomic Analyses

　　

肥胖使个体易发生高凝状态（hypercoagulation），这是中风和心血管疾病等危及生命并发症的关键因素。虽然凝血因子主要由肝脏分泌，但肥胖与高凝状态之间的机制仍不清楚。在本研究中，研究人员建立了一个肥胖队列，并进行了遗传分析、人类肝脏组织的单核（single-nucleus, sn）RNA测序（snRNA-seq）和批量（bulk）RNA测序（bulk RNA-seq），以及体外实验，以阐明潜在机制。遗传分析确定了体重指数（body mass index, BMI）与凝血参数之间的因果关系，特别是纤维蛋白原（fibrinogen）水平升高。临床队列数据表明，BMI与血浆纤维蛋白原水平和纤维蛋白原功能之间存在显著关联。肝脏转录组学数据揭示了BMI与肝脏纤维蛋白原表达之间的显著联系。snRNA-seq数据和bulk RNA-seq的去卷积分析发现了一个特定的肝细胞亚群（Hep5），该亚群显著增加，并负责肥胖中异常的凝血因子分泌。伪时间轨迹分析表明，肥胖患者中白细胞介素6（interleukin 6, IL6）信号传导增强，促进了肝细胞身份相关转录因子CEBPB（CCAAT enhancer binding protein beta）的激活，从而推动其他肝细胞亚群分化为Hep5。在一个独立肥胖队列中的进一步分析证实，血清IL6是BMI-纤维蛋白原关系的关键中介因子，支持了目前处于2b期试验的IL6抗体在改善凝血异常方面的潜在价值。体外实验表明，CEBPB抑制剂海伦那林乙酸酯（helenalin acetate, HA）可逆转由IL6诱导的肝细胞分化相关基因的异常表达。本研究定义了肥胖中的肝脏转录组景观，阐明了纤维蛋白原升高的机制，并强调了管理肥胖中高凝状态的治疗靶点。

**肥胖中高凝状态的肝脏机制与治疗靶点：来自遗传学和转录组学分析的见解——论文解读**

**研究背景与问题**

肥胖是全球性健康挑战，约有6.5亿成年人患有肥胖症。临床和流行病学证据表明，凝血障碍是肥胖的常见特征，与缺血性中风、心肌梗死和肺栓塞等严重不良结局相关。肥胖个体存在血小板过度活跃、纤维蛋白溶解降低以及脂肪因子和促炎因子（如IL6、TNFα和IL1）分泌异常等多种风险因素，导致凝血障碍。然而，既往研究多集中于临床发现，缺乏详细的机制性解释。肝脏作为人体最大的实质器官，负责分泌多种凝血因子，尤其是纤维蛋白原（fibrinogen）和凝血酶原（prothrombin），并在急性和慢性肝损伤中启动修复和再生过程。尽管肥胖与肝细胞损伤及多种肝病（如代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）、肝纤维化和肝细胞癌（HCC））相关，但肥胖通过影响肝细胞功能或分化而诱导凝血异常的机制尚不清楚。因此，本研究旨在阐明肥胖导致高凝状态的肝脏机制，并寻找治疗靶点。该论文发表在《Exploration》。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析，利用GIANT联盟和UK Biobank（UKBB）的遗传数据进行因果推断；2）单核RNA测序（snRNA-seq）和批量RNA测序（bulk RNA-seq），对来自山东大学齐鲁医院的肥胖队列（袖状胃切除术患者）和正常对照（良性肝肿瘤手术患者）的肝脏样本进行转录组分析；3）体外细胞实验，使用HepG2细胞和原代人肝细胞（PHHs）进行药物处理；4）免疫荧光染色，验证肝细胞亚群分布；5）伪时间轨迹分析（Monocle3、CytoTRACE）和转录因子活性预测（DoRothEA、CellOracle）；6）去卷积分析（BisqueRNA、CIBERSORT）解析细胞比例。样本队列包括两个队列：队列1用于bulk RNA-seq（12例对照 vs. 19例肥胖），队列2用于snRNA-seq（2例对照 vs. 2例肥胖），以及一个独立的178例肥胖队列用于血清炎症因子分析。

**研究结果**

**2.1 孟德尔随机化显示BMI是纤维蛋白原水平升高的因果因素**：通过双样本孟德尔随机化分析，从GIANT（P = 4.162×10^-17）和UKBB（P = 4.799×10^-9）数据库中发现，体重指数（BMI）与纤维蛋白原水平升高存在显著因果关系，而与其他凝血参数（如凝血酶原、凝血因子等）无显著关联（经Bonferroni校正后）。

**2.2 临床资料支持BMI与纤维蛋白原水平的因果关系**：对队列1的临床特征分析显示，肥胖组BMI和肝转氨酶（ALT、AST）显著升高，凝血酶时间（TT）缩短，D-二聚体降低，血浆纤维蛋白原呈上升趋势。相关性分析表明，纤维蛋白原与BMI最相关（R = 0.48, p = 0.0059），而TT与BMI负相关。此外，纤维蛋白原编码基因（FGA、FGB、FGG）的mRNA表达水平与BMI和血浆纤维蛋白原均呈显著正相关，提示BMI升高驱动肝脏纤维蛋白原合成增加。

**2.3 肥胖肝脏的单核图谱**：通过snRNA-seq获得27,376个高质量细胞核，鉴定出包括5个肝细胞亚群（Hep1-5）、肝窦内皮细胞（LSEC）、内皮细胞、肝星状细胞（HSC）、库普弗细胞（KC）、胆管细胞/肝祖细胞（Cho/HPC）、B细胞、自然杀伤T细胞（NKT）、T细胞、单核细胞/单核细胞衍生巨噬细胞（Mo/MoMF）和树突状细胞（DC）在内的细胞类型。

**2.4 增加的Hep5比例负责肥胖肝脏中的凝血通路活性**：KEGG通路富集分析显示，Hep5亚群在补体和凝血级联反应中富集。分泌蛋白评分和凝血活性评分（基于HALLMARK_COAGULATION基因集）均显示Hep5最高。三重免疫荧光染色证实Hep5（APOE⁺FGG⁺）存在于肝小叶间带，而非门静脉周围或中央静脉周围。去卷积分析显示，肥胖组Hep5比例显著增加，且与BMI高度正相关（R = 0.61, p = 0.00025）。差异表达分析发现，纤维蛋白原基因（FGA、FGB、FGG）仅在Hep5中于肥胖组上调。亚组分析（按MASLD严重程度和血脂异常分层）表明，肥胖与纤维蛋白原过度分泌的关联独立于MASLD严重程度或脂质代谢紊乱。细胞周期和增殖分析显示，Hep5增加并非由于增殖增强。

**2.5 通过其他肝细胞的分化增强导致Hep5群体增加**：CytoTRACE分析显示Hep5转录多样性最低，表明其处于分化后期状态。伪时间轨迹分析（Monocle3）表明，Hep1-4可向Hep5分化，且肥胖组分化趋势增强。基因轨迹分析（GeneTrajectory）进一步支持了这一方向。与伪时间正相关的基因富集于“血小板脱颗粒”和“补体和凝血级联”，负相关的基因富集于“Hippo信号通路”。

**2.6 增强的IL6/CEBPB信号在肥胖个体中诱导Hep5分化**：转录因子活性分析（DoRothEA）发现，CEBPB（NFIL6）活性与伪时间值最显著正相关（R = 0.33, P < 1×10^-4），在肥胖组Hep1、Hep2和Hep5中活性上调。CellOracle模拟显示，CEBPB敲除抑制向Hep5分化，过表达则促进分化。在178例肥胖患者中，血清IL6与BMI和纤维蛋白原均显著正相关，且部分Spearman相关分析表明，校正IL6后BMI与纤维蛋白原的相关性显著减弱，而其他炎症因子无此效应。IL6受体（IL6R）在Hep5中表达上调最显著，且JASPAR预测CEBPB结合于IL6R启动子区域。

**2.7 CEBPB抑制剂海伦那林乙酸酯逆转IL6诱导的肝细胞分化相关基因异常表达**：体外实验显示，IL6（10 ng/mL）处理HepG2细胞后，纤维蛋白原基因（FGA、FGB、FGG）、SERPINA1、APOC1等伪时间正相关基因mRNA表达升高，而ZBTB20、CYP3A4、SOX5、GPHN等负相关基因表达降低；加入CEBPB抑制剂HA（1 nM）后，这些异常表达被逆转。在原代人肝细胞中，siRNA敲低CEBPB或HA处理均能抑制IL6诱导的纤维蛋白原相关基因表达。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，本研究通过孟德尔随机化建立了BMI与纤维蛋白原升高的因果关系，并利用snRNA-seq图谱揭示了肥胖中Hep5亚群增加及其通过IL6/CEBPB信号通路分化增强的机制。IL6作为关键中介因子，其抗体（如ziltivekimab、clazakizumab）在2b期试验中显示出降低纤维蛋白原的潜力。CEBPB抑制剂HA虽具毒性，但可能通过靶向递送系统应用于肝脏。研究存在局限性，如初始snRNA-seq队列规模较小且仅包含绝经前女性，以及缺乏直接谱系追踪实验验证。研究结论部分原文为：“In summary, Mendelian randomization analysis and the comprehensive transcriptomic atlas of obese livers together uncovered the causal relationship between BMI and elevated fibrinogen levels, as well as the increased likelihood of differentiation into fibrinogen-secreting hepatocytes, which may be alleviated with therapeutic antibodies targeting IL6. This study can serve as a reference to guide further research and development of advanced therapeutic strategies for treating hypercoagulation and other obesity-related disorders.” 翻译为：总之，孟德尔随机化分析和肥胖肝脏的综合转录组图谱共同揭示了BMI与纤维蛋白原水平升高之间的因果关系，以及向分泌纤维蛋白原的肝细胞分化的可能性增加，这种分化可能通过靶向IL6的治疗性抗体得到缓解。本研究可作为指导进一步研究和开发治疗高凝状态及其他肥胖相关疾病的先进治疗策略的参考。