HNSCC患者循环CD4+、CD8+、CD19+淋巴细胞中细胞衰老相关基因表达：与临床参数的关联

《Cells》：Cellular Senescence-Associated Gene Expression in Circulating CD4+, CD8+, CD19+ Lymphocytes of HNSCC Patients: Associations with Clinical Parameters

　　

衰老相关分泌表型(SASP)信号，连同关键标志物如P16^INK4a/CDKN2A和LMNB1，尚未在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的循环淋巴细胞亚群中进行系统研究。本研究旨在评估外周血CD4⁺、CD8⁺和CD19⁺细胞中SASP相关基因和衰老标志物，并评估其临床相关性。研究人员通过RT-qPCR测量了来自58例基线HNSCC患者、31例治疗后患者和13例对照的分选淋巴细胞中IL-6、IL-1β、TNFα、CXCL1、P16^INK4a/CDKN2A和LMNB1的表达。统计分析包括非参数检验、相关性分析和生存模型(Kaplan–Meier、Cox回归)。结果中，LMNB1在HNSCC患者的所有淋巴细胞亚群中显著上调。IL-6、CXCL1和IL-1β在CD4⁺ T细胞中升高。观察到涉及IL-6、CXCL1、IL-1β、P16^INK4a/CDKN2A和LMNB1的协调共表达网络。临床上，CD8⁺ T细胞中的IL-6与较高的淋巴结分期和较差的生存相关，而CD19⁺ B细胞中的CXCL1独立预测生存。治疗前后样本之间未发现差异。HNSCC的循环淋巴细胞显示出选定的衰老相关基因的协调表达，其中IL-6和CXCL1作为与肿瘤进展相关的候选预后生物标志物，有待进一步验证。

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是一种免疫抑制性恶性肿瘤，尽管肿瘤免疫微环境已被广泛研究，但外周血循环淋巴细胞亚群在诊断时的转录组特征仍不清楚。临床治疗（如手术和放疗）会诱导系统性免疫变化，包括淋巴细胞减少和中性粒细胞-淋巴细胞比值(NLR)改变，这些与预后相关。然而，系统性免疫改变与衰老相关信号之间的关联尚未明确，尤其是在HNSCC的特定淋巴细胞亚群水平。细胞衰老是一种应激反应，其分泌表型(SASP)可重塑微环境；先前研究已显示HNSCC肿瘤组织中SASP基因表达与不良临床病理特征相关，但衰老对系统性免疫的贡献尚待探索。为此，研究人员开展了本研究，旨在分析HNSCC患者循环CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺淋巴细胞中衰老相关基因的表达，并评估其临床意义。研究得出以下结论：LMNB1在所有亚群中一致上调，IL-6、CXCL1、IL-1β等在CD4⁺ T细胞中升高，并形成协调共表达网络；IL-6在CD8⁺ T细胞中的表达与较高淋巴结分期和较差生存相关，CXCL1在CD19⁺ B细胞中独立预测生存。这些发现表明循环淋巴细胞中存在衰老相关转录印迹，IL-6和CXCL1可作为候选预后生物标志物。该论文发表在《Cells》。

**关键技术方法**：样本来自波兰波兹南医科大学头颈外科及波兰大癌症中心，纳入58例HNSCC患者基线（治疗前）和31例治疗后样本，以及13例健康对照。采用Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和CD19⁺ B细胞。利用RT-qPCR检测IL-6、IL-1β、TNFα、CXCL1、P16^INK4a/CDKN2A和LMNB1的表达，以GAPDH为内参，采用Pfaffl法计算相对表达量。统计分析包括非参数检验、Fisher精确检验、Pearson/Spearman相关性分析、Kaplan–Meier生存分析和Cox比例风险回归模型。

**研究结果**：

**3.1 与健康对照相比，HNSCC患者CD4⁺循环淋巴细胞中LMNB1、IL-6、IL-1β显著上调**：通过比较基线HNSCC患者(T0)、治疗后患者(T1)和健康对照(CTR)中六个基因在三种淋巴细胞亚群中的相对表达水平，发现LMNB1在CD4⁺、CD8⁺和CD19⁺细胞中均显著上调（p值分别为0.0003、0.0087、0.046）。IL-6和IL-1β在CD4⁺ T细胞中显著升高（p=0.0229, p=0.0221），CXCL1在CD4⁺ T细胞中亦升高（p=0.0346）但非检测样本比例较高。P16^INK4a/CDKN2A和TNFα在各亚组间无显著差异。治疗前后比较未发现显著变化。

**3.2 HNSCC患者循环淋巴细胞亚群中衰老相关基因的共表达**：对T0样本进行两两相关性分析，发现IL-6与CXCL1在所有三个亚群中均呈最强且最一致的共表达（p<0.0001）。IL-6与IL-1β、IL-1β与CXCL1亦显著相关（均p<0.0001）。P16^INK4a与LMNB1在三个亚群中均显著相关（CD4⁺ p=0.0087，CD8⁺ p<0.0001，CD19⁺ p<0.0001），且两者均与IL-6和CXCL1显著相关，形成包含IL-6、CXCL1、IL-1β、P16^INK4a和LMNB1的共表达模块。TNFα与上述基因无显著相关，提示其受独立程序调控。

**3.3 基因表达状态与特定细胞亚群中的临床和血液学参数相关**：将患者按基因表达阳性/阴性分层，比较临床和血液学参数。在CD4⁺ T细胞中，IL-6阳性与较低单核细胞计数相关；TNFα和P16^INK4a阴性与较高单核细胞计数相关；IL-1β阴性患者年龄较大。在CD8⁺ T细胞中，IL-6阳性与较高淋巴结分期相关（p=0.0058），LMNB1阳性与较高肿瘤分期相关（p=0.0093）；IL-1β阴性患者年龄较大，P16^INK4a阴性患者年龄较小且单核细胞计数较高。在CD19⁺ B细胞中，IL-6阳性与较高淋巴细胞和嗜碱性粒细胞计数相关。

**3.4 CD8⁺细胞中IL-6表达和CD19⁺细胞中CXCL1表达与总生存相关**：Kaplan–Meier分析未发现显著差异，但单变量Cox回归显示CD8⁺ T细胞中IL-6表达与总生存显著相关（p=0.0313），CD19⁺ B细胞中CXCL1表达亦显著相关（p=0.0055），低表达与较好生存对应。将两者纳入多变量模型（含交互项）后，模型预测价值提高（AIC降低），提示高表达预示不良预后。

**讨论总结**：研究揭示了HNSCC患者循环淋巴细胞中衰老相关基因的协调表达模式。LMNB1的普遍上调并非经典衰老标志，可能反映应激适应性核重塑。IL-6/CXCL1/IL-1β/P16^INK4a/LMNB1共表达簇与SASP特征一致，而TNFα独立于该簇，表明存在至少两种不同的炎症程序。CD8⁺ T细胞中IL-6与淋巴结分期和生存相关，支持其作为免疫衰老与肿瘤交界处的预后生物标志物。CXCL1在B细胞中的关联虽初步但需验证。治疗前后表达稳定，提示反映患者基线免疫特征。局限性包括样本量小、年龄/性别不匹配、非检测值比例高、HPV/CMV状态未知、缺乏功能实验及细胞亚群异质性。

**研究结论**：本研究首次系统表征了HNSCC患者FACS分选的循环CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和CD19⁺ B细胞中衰老相关和炎症基因表达。LMNB1在所有三个淋巴细胞亚群中一致上调，并与CD8⁺ T细胞中较高肿瘤分期相关。重要的是，这种上调与经典衰老中LMNB1的丢失相反，提示一种非经典的压力适应性模式，可能反映肿瘤驱动的核重塑而非经典衰老标志。在全部淋巴细胞群体中一致识别出一个包含IL-6、CXCL1、IL-1β、P16^INK4a和LMNB1的协调SASP样共表达簇，而TNFα始终与该簇分离，提示HNSCC患者循环淋巴细胞区室中至少存在两种不同的炎症程序。基线时CD8⁺ T细胞中IL-6表达与较高淋巴结分期和较短总生存相关，表明其在免疫衰老与肿瘤生物学交汇处具有潜在预后生物标志物作用。CD19⁺ B细胞中CXCL1表达显示出类似关联，但这一观察是初步的，需在更大队列中验证。基因表达谱在治疗期间保持稳定，提示其反映个体基线免疫特征而非动态治疗反应。这些探索性发现支持HNSCC中衰老相关分析的可行性，并将CD8⁺细胞中的IL-6和CD19⁺细胞中的CXCL1确定为值得前瞻性验证的候选预后生物标志物。