综述：安第斯作物中的生物活性肽：乳酸菌发酵、互补蛋白水解和生物活性

《Foods》：Bioactive Peptides from Andean Crops: Lactic Acid Bacteria Fermentation, Complementary Proteolysis, and Biological Activities

　　

安第斯作物，包括藜麦（Chenopodium quinoa）、苋属物种包括kiwicha（Amaranthus caudatus）、chocho（Lupinus mutabilis）和ca?ihua（Chenopodium pallidicaule），构成了通过微生物发酵和酶促蛋白水解生成生物活性肽的有前景的蛋白质基质。这些伪谷物和豆类含有储存蛋白，主要是11S球蛋白（11S globulins）和2S白蛋白（2S albumins），富含赖氨酸和含硫氨基酸，因此为多功能肽提供了合适的先导物。此外，次级代谢产物，如藜麦皂苷和chocho生物碱，可能影响发酵过程中的蛋白水解、肽释放和肽稳定性。本综述批判性地审视了乳酸菌发酵（LAB fermentation）作为从安第斯作物中生产生物活性肽的一种食品级策略。从酶水解和模拟胃肠消化中获得的证据被作为补充信息纳入，并与发酵来源的证据分开讨论。报道的活性包括抗氧化、ACE抑制（ACE-inhibitory）、DPP-IV抑制（DPP-IV-inhibitory）和α-葡萄糖苷酶抑制（α-glucosidase-inhibitory）、抗菌和抗炎活性。特别关注了肽的生成、分子量分级、肽组学表征、结构–活性关系、模拟胃肠消化和生物可及性。大多数报道的活性是在水解物或分子量级分中测量的，而非在确定的序列中，且单独验证的肽仍然占少数。不同作物间的证据强度差异显著：对于藜麦和苋属，发酵来源的数据更为完善，而chocho和ca?ihua的证据主要依赖于酶水解。同时讨论了当前存在的局限性，包括底物变异性、感官可接受性、工艺标准化、肽鉴定、生物利用度以及缺乏人体验证研究。安第斯作物蛋白是有前景的功能性肽成分的前体；然而，肽特异性的生物利用度和人体功效在很大程度上仍未得到测试。

1. 引言
食品来源的功能性蛋白和生物活性肽在开发促进健康的食品系统中日益被视为关键组分。生物活性肽是隐藏在膳食蛋白中的短氨基酸序列，仅在通过酶水解、胃肠消化或微生物发酵等蛋白水解过程释放后才具有活性。一旦释放，这些序列可作为分子效应物，调节包括心血管调节、氧化还原稳态、炎症反应、代谢控制和宿主-微生物相互作用在内的生理过程。其多功能特性使其处于食品科学、营养学、分子生物学和功能食品开发的交叉领域。同时，向可持续和韧性食品系统的转变，加强了对超出传统营养价值的植物源蛋白来源的探索。在此背景下，安第斯作物作为生物化学和农学上相关的来源重新出现。

2. 安第斯作物的蛋白质组学架构和次级代谢产物背景
安第斯作物具有区别于常规谷物的蛋白质组学架构，使其成为乳酸菌发酵（LAB fermentation）的合适底物。与以醇溶蛋白为主的谷物不同，安第斯储存蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成。这些组分富含11S球蛋白（11S globulins）和2S白蛋白（2S albumins），其骨架含有高水平的赖氨酸（常被谷物限制的必需氨基酸）以及含硫残基（如半胱氨酸和蛋氨酸）。由此产生的氨基酸基序为与血管紧张素转换酶（ACE）、二肽基肽酶-IV（DPP-IV）和氧化应激介质等分子靶点具有亲和力的生物活性肽序列提供了前体。此外，这些蛋白相对开放的三级和四级结构，由链间和链内二硫键稳定，但含有可及的亲水结构域，有利于在乳酸菌衍生肽酶作用下产生多样化的蛋白水解肽图谱，生成低分子量肽（<3 kDa），具有多种生物活性。在藜麦中，成熟种子蛋白约含37%的11S型球蛋白（chenopodin）和35%的2S白蛋白，以及少量谷蛋白和醇溶蛋白。Chenopodin是一种六聚体储存蛋白，由二硫键连接的酸性和碱性亚基组成，而较小且更亲水的2S白蛋白则代表不同的蛋白组分。这些结构差异预计会影响蛋白水解可及性，但其对乳酸菌发酵中肽释放的具体贡献尚未被系统量化。苋属物种表现出类似的蛋白质组学特征，以11S球蛋白（amarantin）为主要储存组分，同时含有2S白蛋白和谷蛋白。Amarantin是一种天然状态下约398 kDa的六聚体球蛋白，由酸性和碱性亚基组成，富含必需氨基酸，包括赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。Chocho以其高总蛋白含量（干重38-53%）著称，球蛋白占蛋白质组的91-94%，主要11S型球蛋白（包括α-、β-和δ-伴球蛋白）与大豆球蛋白结构同源，但氨基酸组成独特，富含精氨酸和亮氨酸，赖氨酸水平超过许多豆类。白蛋白仅占约6%，使chocho成为球蛋白主导的平台，其蛋白高度易被蛋白水解，并释放具有广泛生物活性的生物活性肽。第二个支持安第斯作物用于肽生物生产的特征是次级代谢产物的存在，这些代谢物在乳酸菌发酵过程中与蛋白水解环境动态相互作用。在藜麦中，三萜皂苷（含量0.22-15.04 mg/g，主要集中于果皮）传统上因苦味和膜破坏活性被视为抗营养因子。然而，乳酸菌菌株如植物乳杆菌（L. plantarum）和副干酪乳杆菌（L. paracasei）产生β-葡萄糖苷酶和酯酶，可将皂苷降解为苦味较弱的苷元和多糖。在chocho中，喹诺里西啶生物碱（主要是羽扇豆碱，以及鹰爪豆碱、安格司汀碱等）在未加工种子中可能达到种子干物质的3-5%，并具有苦味和蛋白酶抑制效应。水煮脱苦或乳酸菌发酵可将这些生物碱降低至痕量残留水平。总体而言，储存蛋白组成和基质植物化学物质定义了可能影响发酵过程中蛋白水解的条件，但直接证据表明其对肽产量、多样性或生物活性的协同效应仍有限。

3. 发酵、加工和肽组学表征
基于上述生化背景，乳酸菌发酵是利用安第斯作物蛋白释放肽的重要食品级策略，也是本综述的主要焦点。该过程利用如植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和粪肠球菌等菌株的胞外和胞内肽酶系统，在温和条件下实现可控蛋白水解。细胞包膜蛋白酶和胞内肽酶依次作用，将白蛋白和球蛋白水解为低分子量肽。发酵通常在30-37°C、初始pH 6.0-7.0、孵育24-72小时条件下进行。此过程中，乳酸产生降低pH，提高蛋白溶解度和酶-底物相互作用，同时减少抗营养因子。固态发酵和液态发酵均已成功应用。标准化生产流程始于富含蛋白底物的制备；脱脂面粉或浓缩物经水或弱碱提取后，在可控固态或液态条件下发酵；发酵后水解物经离心澄清，通过顺序超滤分馏，常用分子量截留膜为10、5、3和1 kDa。多项研究报道低分子量级分（通常低于3 kDa）中生物活性富集，但分子大小本身并非活性决定因素，活性还取决于肽序列、电荷、疏水性和测定条件。生物活性级分的肽组学表征通过液相色谱-串联质谱进行，工作流程包括肽分离、电喷雾电离和碰撞诱导解离，母离子和碎片谱图通过数据依赖性模式采集并与物种特异性蛋白数据库匹配或使用从头测序算法解读。在藜麦中，纳米LC-ESI-MS/MS已鉴定出发酵面粉提取物中的5-9残基肽；在苋属中，经粪肠球菌LR9发酵后，同一平台鉴定出125个新序列，其中10个显示高预测ACE抑制潜力。圆二色谱分析表明，许多活性肽采取α-螺旋或随机卷曲构象，有利于靶标结合。酶水解提供了互补的肽生成策略，但可用的证据不支持酶水解或乳酸菌发酵本身具有内在优势的普遍结论。

4. 来自安第斯食品基质的作物特异性证据
藜麦是通过乳酸菌发酵生成生物活性肽研究最广泛的安第斯作物。藜麦粉与本地植物乳杆菌的固态发酵显著提高了DPPH自由基清除活性，较未发酵对照提高达2倍，这与疏水和芳香族氨基酸富集序列的蛋白水解释放以及结合酚类物质的生物转化有关。藜麦蛋白与副干酪乳杆菌的液态发酵生成了有效的抗高血压肽，包括NIFRPFAPEL，其抑制ACE的IC50为49.02 μM，通过氢键与ACE活性位点残基（包括Tyr523和Glu384）竞争性结合，并在模拟胃肠消化后保留显著活性。发酵藜麦制品与肠道微生物组成变化相关，但这些效应目前不能专门归因于发酵衍生的肽。苋属也提供了乳酸菌发酵过程中肽释放的直接证据。在一项比较研究中，粪肠球菌LR9发酵产生79.1±2.6%的ACE抑制率，而肠膜明串珠菌18C6和Alcalase处理分别为68.0±9.8%和69.4±1.2%。补充研究使用乳酸杆菌Shirota和嗜热链球菌54102的单培养和共培养，确认了从苋属蛋白中释放出具有抗高血压、抗血栓和抗氧化活性的肽。Kiwicha主要通过酶水解和模拟胃肠消化进行研究，而非乳酸菌发酵，专门的乳酸菌发酵研究仍有限。Chocho提供了大量但尚未充分开发的乳酸菌发酵衍生肽潜力，当前证据主要来自Alcalase优化酶水解，产生具有高水解度和强抗氧化活性的水解物，超滤级分显示ACE抑制、DPP-IV抑制、α-葡萄糖苷酶抑制和抗高血压特性。直接对chocho进行乳酸菌发酵的研究仍较伪谷物少。Ca?ihua是肽相关发酵研究中研究最少的安第斯伪谷物，其生物活性潜力的主要证据来自酶水解研究。顺序中性蛋白酶-Alcalase处理ca?ihua蛋白浓缩物产生具有强抗氧化活性和ACE抑制的水解物，进一步超滤和尺寸排阻色谱得到<3 kDa级分，LC-MS/MS鉴定出源于11S种子球蛋白的3-11个氨基酸肽。此外，ca?ihua谷蛋白级分的Alcalase和胃蛋白酶-胰酶水解物释放出对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有活性的抗菌肽。在分析的所有作物中，低分子量级分最常与生物活性相关，尽管该观察既基于乳酸菌发酵也基于酶水解研究。发酵衍生的证据主要局限于藜麦和苋属，对于chocho和ca?ihua，记录几乎完全由水解研究组成，这指出了差距而非提供了外推基础。

5. 功能特性和生物活性
来自安第斯作物的肽和富含肽的级分显示出多种体外生物活性，尽管证据来自乳酸菌发酵和非发酵性水解。在各研究中，最活跃的级分通常富含低分子量肽，最常低于3 kDa。低分子量级分常富集活性，但分子大小本身不能预测生物效力或肠道吸收。然而，现有证据在不同作物和生物活性之间分布不均：抗高血压和抗氧化活性是记录最完善的，而序列分辨的抗菌和抗炎数据仍相对有限，特别是对于严格乳酸菌发酵的安第斯基质。ACE抑制是安第斯作物衍生肽中测定的最一致活性。在藜麦中，固态发酵生成肽富集级分，其中<3 kDa级分显示出高且稳定的ACE抑制活性，NIFRPFAPEL和AALEAPRILNL随后被验证为单个肽。在苋属中，粪肠球菌LR9发酵产生水解物，ACE抑制率为79.1±2.6%，LC-MS/MS鉴定出125个肽序列，其中IFQFPKTY和VIKPPSRAW通过生物信息学和对接分析被优先考虑。对于chocho，数据存在于水解物和单个肽水平，但均非来自乳酸菌发酵；酶水解产生的低分子量级分包含25个肽，其中AVPFWM、YSGWLGL、AHAGFGMLY和FFSMKVM首先通过计算筛选，三个随后被合成并测定，给出ACE IC50值。Ca?ihua可描述为ACE抑制肽级分的来源，但尚无验证的单个序列。抗氧化活性已通过DPPH、ABTS、FRAP、ORAC和金属螯合等方法评估，通常在蛋白水解和分馏后增加。发酵苋属提取物显示ABTS和FRAP活性增加，但这些测定不建立肽与其他发酵衍生代谢物的相对贡献。在藜麦中，发酵和肽富集也改善抗氧化性能，尽管许多研究在级分水平而非单个序列水平报告活性。Tarwi为抗氧化活性提供了更强的序列分辨率，四个优先肽中三个被合成并实验确认抗氧化活性。Ca?ihua纯化的低分子量级分达到3.18 μmol TE/mg，但单个肽的抗氧化活性未被测量。DPP-IV和α-葡萄糖苷酶抑制通常用作筛选食品衍生肽对餐后血糖调节潜在效应的体外终点。在发酵藜麦饮料中，两个肽VAHPVF和LAHMIVAGA被报告为双ACE和α-葡萄糖苷酶抑制剂。Tarwi/chocho衍生肽显示出显著的DPP-IV抑制特性，水解γ-伴球蛋白制剂强烈抑制DPP-IV，并增强葡萄糖摄取和减少糖异生。与藜麦和tarwi相比，苋属和ca?ihua的抗糖尿病肽证据更为有限。抗菌活性是安第斯作物衍生肽的另一个相关功能特性。在藜麦中，皂苷和富含肽的水解物均贡献抗菌活性。苋属通过天然蛋白和肽水解物提供大量抗菌证据。Tarwi显示更有限但有前景的抗菌证据。Ca?ihua通过酶水解种子蛋白获得的肽级分贡献了新兴证据。抗炎效应与NF-κB和NLRP3炎症小体信号通路的调节有关。在藜麦中，这些效应与皂苷、肽和蛋白水解物相关，但几项抗炎观察来自皂苷级分或全提取物，不应解释为肽特异性效应。苋属也通过富含肽的水解物显示出抗炎潜力。对于chocho和ca?ihua，直接证据仍有限。研究间的比较受到方法学异质性的限制，包括肽生成方式、底物制备、蛋白酶特异性、发酵条件等。肽分辨率方面，活性常在整体水解物或分子量级分中测量，而肽序列随后通过LC-MS/MS鉴定，但鉴定出的肽不一定就是所测活性的贡献者。定量比较需要谨慎，因为百分比抑制不能直接与IC50比较，抗氧化测定方法也不同。表2区分了四种肽特异性证据水平，包括单独验证的肽、活性级分或水解物、鉴定但未测试的序列，以及计算候选物。

6. 分子机制、对接和结构-活性关系
分子对接和结构-活性关系分析有助于定义来自安第斯作物的发酵衍生肽如何与其分子靶点相互作用。结合酶抑制动力学和细胞测定，这些方法确定了与生物活性相关的结合模式、相互作用残基和结构特征。对接提供肽-靶点相互作用的结构假设，但不证明抑制作用。对于ACE抑制，对接研究表明安第斯肽通过氢键、疏水接触和静电相互作用结合在催化位点或其邻近区域。藜麦衍生肽NIFRPFAPEL作为竞争性抑制剂，与Tyr523和Glu384形成氢键，其C端亮氨酸在ACE活性位点内贡献疏水锚定。第二个藜麦衍生肽AALEAPRILNL显示非竞争性抑制，通过催化口袋外相互作用稳定酶-肽复合物而不直接阻断底物通道。在苋属中，IFQFPKTY和VIKPPSRAW显示与ACE S1和S2亚位点的强预测结合，其芳香族和疏水残基与His383、His387和Tyr523建立π-π堆积和范德华接触。Chocho肽级分对ACE也显示高对接得分，精氨酸和亮氨酸富集序列贡献额外的静电稳定。抗糖尿病靶点的对接研究进一步展示了安第斯肽的功能多功能性。藜麦衍生低分子量级分通过混合型可逆动力学抑制α-葡萄糖苷酶，分子模拟表明疏水斑块和脯氨酸残基诱导酶活性位点构象变化，降低底物亲和力而不完全封闭催化亲核体。Chocho水解物也对接至DPP-IV和α-葡萄糖苷酶，含脯氨酸序列通过氢键占据DPP-IV S1口袋，疏水残基增强α-葡萄糖苷酶结合。结构-活性关系分析揭示了与生物活性相关的保守特征：ACE抑制肽通常为2-12残基，C端具有疏水氨基酸（Leu、Ile、Val、Phe），N端具有芳香族或支链残基；抗氧化活性与Tyr、Trp、Phe、Cys、Met或His残基相关；DPP-IV抑制偏好倒数第二位为脯氨酸；净正电荷和两亲性有助于抗菌膜破坏。圆二色谱数据表明，许多活性序列采用α-螺旋或柔性随机卷曲构象，有利于诱导契合结合。分子动力学模拟进一步表明，这些复合物在生理pH和温度下保持稳定。

7. 胃肠稳定性和生物可及性
除了与靶酶的分子相互作用外，胃肠稳定性是决定发酵衍生肽潜在生物可及性和生理功效的关键因素。在藜麦中，抗高血压肽NIFRPFAPEL在副干酪乳杆菌发酵中释放，对模拟胃肠消化表现出高抗性，顺序暴露于胃蛋白酶和胰酶后肽完整性基本保持，仅有限降解，ACE抑制活性仍保持在可能抗高血压效应兼容的水平。发酵藜麦基质还显示，消化后水解物可能表现出增加的抗氧化能力，这可能是由于转运过程中产生次级生物活性片段。在苋属中，发酵水解物在消化后也保留显著生物活性；动态体外消化实验表明，ACE抑制能力在胃相和肠相均得到保留，最终消化物的纯化级分活性更高，确认了生物活性肽能存活胃肠转运并进一步富集。Kiwicha蛋白水解物在模拟胃肠消化后释放具有高生物可及性的活性肽，消化率约71-79%，肠相促进必需氨基酸和活性片段的释放，>5 kDa级分显著影响结肠癌细胞活力，而<5 kDa级分在ACE抑制和抗氧化活性中占主导。Chocho和ca?ihua的数据仍有限，特别是对于发酵衍生肽。Chocho蛋白的酶水解物显示良好的体外消化性，并在消化后保留抗氧化、ACE抑制和抗糖尿病活性；ca?ihua水解物产生低分子量肽，在模拟胃肠暴露后仍保持活性。最近使用INFOGEST 2.0方案的标准化消化研究提供了安第斯作物蛋白胃肠行为的额外背景，但大多数检查了非发酵基质。在藜麦和ca?ihua中，INFOGEST 2.0消化揭示高蛋白消化率（71-79%）和保留抗氧化及ACE抑制活性的生物活性片段释放。然而，INFOGEST 2.0尚未应用于乳酸菌发酵的安第斯基质，限制了与本综述讨论的发酵衍生肽的直接比较。乳酸菌发酵后安第斯作物中占主导的低于3 kDa级分在模拟消化中显示合理稳定性，一些序列抵抗完全蛋白水解，并在少数报告中于肠转运期间产生额外活性片段。这些观察涉及生物可及性而非生物利用度；存活消化并不证明肽能穿过肠上皮或进入循环。对于安第斯作物衍生肽，尚无研究将标准化消化模型与上皮转运系统和靶向LC-MS/MS检测转运序列相结合，这是从生物可及性迈向生物利用度的最低要求。

8. 转化挑战和未来展望
选择性肽和水解物存在临床前证据，但转化为商业产品仍有限。大多数研究在实验室或小中试规模进行，未充分反映工业生产的操作和经济约束。一个主要局限是种质标准化，影响肽谱和生物活性重现性。藜麦种质在皂苷含量上差异显著，甜味品种<0.11%，苦味品种超过1%，这些化合物可干扰蛋白酶活性和蛋白水解动力学。Chocho在喹诺里西啶生物碱上呈现显著变异，水平从0.5%到3-5%，甚至高至10%的原料种子，这些生物碱赋予强烈苦味并可能抑制乳酸菌，损害发酵性能。苋属品种在蛋白含量和氨基酸组成上也有差异，影响加密生物活性序列的可用性。农艺因素进一步增加批次间变异，使原材料标准化和质量控制系统复杂化。工业发酵必须平衡多个目标：有效脱除chocho生物碱、可控降解藜麦皂苷而不产生异味、最大化生物活性肽产量以及维持微生物安全性。固态发酵和液态发酵的选择是核心，前者可产生更高肽浓度并类似传统安第斯加工，但放大受限于不均匀温度和pH梯度及有限过程控制；后者提供更好控制、无菌性和可扩展性，但需要更高水输入和额外下游浓缩步骤。两种系统中，乳酸菌菌株选择仍关键，但菌株依赖性差异仍限制标准化和重现性。感官可接受性，特别是苦味，是消费者接受度和商业可行性的另一个主要障碍。苦味主要源于蛋白水解过程中暴露的疏水氨基酸，尤其在1-3 kDa肽范围内，该范围常与最佳生物活性相关。传统脱苦策略（如吸附和萃取）可非选择性地去除肽，从而降低生物活性。包封方法（如藻酸盐-果胶珠、壳聚糖基系统、脂质体载体）可在模拟胃肠消化期间掩蔽苦味并保留功能特性，但增加生产成本并需进一步验证。生物利用度仍是一个关键的转化挑战。尽管一些低分子量肽对胃肠消化具有抗性并可能通过载体介导或旁细胞途径发生肠道转运，但胃肠稳定性本身不能保证生物功效。消化后，活性肽必须穿过肠上皮、耐受肠细胞和肝脏的首过代谢、进入体循环、到达分子靶点，并保持足够稳定以发挥生理效应。肠道吸收效率取决于肽大小、氨基酸序列、疏水性、电荷和对刷状缘肽酶的敏感性。大多数安第斯作物衍生肽尚未使用先进体外模型（如Caco-2单层）或体内系统进行全面评估，现有研究结果不一，且几乎没有来自藜麦、苋属、chocho或ca?ihua的发酵衍生肽的人体药代动力学数据。因此，关键的药代动力学参数（包括吸收效率、血浆生物利用度、代谢转化、组织分布、消除、血浆半衰期和剂量-反应关系）在很大程度上未知。这种ADME信息的缺乏是将在有前景的体外发现转化为临床相关功能食品或营养保健品的主要障碍之一。未来研究应结合标准化消化模型与肠道转运测定、基于LC-MS/MS的药代动力学分析，以及设计良好的动物和人体干预研究。监管框架进一步复杂化商业化。在欧盟，健康声明需要基于设计良好的随机对照试验的强有力证据；在美国，结构-功能声明允许但需科学证实，而疾病相关声明需要完全监管批准。目前，安第斯作物肽的证据基础主要依赖体外测定和动物模型，缺乏稳健的人体临床试验。从已确定的差距出发，提出了四项要求：标准化加工和生物活性测定、候选序列的验证、肠道转运和药代动力学测量，以及使用来自明确作物种质的标准化制剂在人体中进行的可控研究。菌株工程（包括CRISPR方法）可能产生具有更高蛋白水解活性和对皂苷及生物碱耐受性的乳酸菌。同时，整合肽组学、代谢组学和宏基因组学的多组学方法可提供对发酵和肽生成的系统水平理解，促进合理过程优化。计算工具（包括分子对接和机器学习）可帮助在实验工作前对候选物进行排序，但这些方法补充而非替代实验验证。最后，来自藜麦、苋属和chocho的生物活性肽的开发与全球可持续食品系统优先事项一致，这些作物对干旱、盐分和贫瘠土壤等不利环境条件适应良好，是农业多样化和粮食安全的有价值资源。

9. 结论
当前证据支持安第斯作物蛋白作为生物活性肽的前体，尽管证据的强度和来源在不同作物间差异显著。直接的乳酸菌发酵证据在藜麦和苋属中最为完善，而chocho和ca?ihua的研究主要依赖酶水解或模拟胃肠消化。ACE抑制和抗氧化活性是报告最一致的终点，但大部分证据仍处于水解物或肽级分水平。在活性级分中鉴定出一个序列并不建立序列特异性活性，分子对接应视为预测性而非实验性证据。转化仍受限于方法学异质性、不完整的肽验证、不确定的肠道吸收和全身暴露，以及人体药代动力学和干预研究的近乎缺失。同样，发酵基质报告的微生物组效应尚不能专门归因于肽。未来工作应优先考虑标准化加工和生物活性测定、候选肽的直接验证、肠道转运和药代动力学研究，以及可控的人体试验。这些步骤是将安第斯作物衍生肽的生化活性转化为基于证据的功能食品声明所必需的。