《Foods》：Identifying Key Bioactive Components in Postbiotic Preparations: From Candidate Discovery to Functional Validation
后生元制剂（postbiotic preparations）含有无生命的微生物细胞以及细胞壁结构、蛋白质、多糖、脂质、代谢物和囊泡相关材料的多样化混合物。尽管这些成分中有许多已被提议为关键生物活性物质，但大多数是通过组成分析、活性组分富集或纯化分子测试来鉴定的。这些发现证明了生物活性，但未必表明某个候选成分对原始制剂的效应有贡献。本综述考察了用于缩小候选清单和评估功能贡献的实验方法，包括表型引导比较、活性引导分离、选择性去除、多组学分析、结构表征、剂量-反应测试、机制干预和重组。研究人员对Web of Science核心合集、PubMed和Scopus进行了截至2026年3月30日的结构化叙述性检索，并辅以引文追踪，确定了相关文献；筛选出15项代表性原始研究，这些研究检查了明确的候选成分并提供了超越组成检测的证据，在七个制剂层面归因领域进行了评估。对代表性研究的评估表明，当前证据主要支持单个候选成分的活性，而制剂层面归因仍不常见。更强的证据需要在源材料中量化候选成分，在适当对照下进行选择性去除，并以制剂相关剂量进行恢复。还必须考虑结构异质性、加工历史、分子状态、剂量和实验背景。这种基于证据的方法可以支持生物活性成分验证、批次一致性以及未来临床前和人类研究的设计。
**1. 引言**
后生元（postbiotic）因其稳定性、安全性和加工兼容性而受到关注，但复杂制剂的益处报道增多，而具体成分的直接贡献尚未明确建立。研究需区分候选发现与因果归因。热灭活Akkermansia muciniphila的外膜蛋白Amuc_1100重现了部分屏障和代谢效应，但未证明其在源制剂中的贡献。活性引导分离、多组学分析等方法可定位活性，但差异丰度不等于功能必要性。后生元制剂中无生命细胞、包膜结构、可溶性代谢物、胞外囊泡和裂解物共存，其相对丰度和可及性取决于菌株、培养、灭活、加工和基质。现有综述多关注定义和功能，较少聚焦实验设计如何建立成分对制剂的贡献。本综述评估了表型引导比较、分离、选择性去除、多组学分析、结构表征、重组、剂量-反应分析、受体干预和跨模型验证等方法的优势、局限和常见误解，并采用结构化证据方案区分候选提议、活性相关候选、类别级贡献、候选特异性功能支持和制剂锚定贡献。
**文献检索与研究选择**
检索了Web of Science核心合集、PubMed和Scopus至2026年3月30日的文献，结合后生元制剂、候选成分和功能评估术语。选择15项原始研究，这些研究检查了明确定义的候选分子、成分类别或分子特征，并提供了超越组成检测的证据（如分离、候选测试、去除或添加回补、剂量-反应、机制干预或体内验证）。研究覆盖主要成分类别和证据类别，表格代表性而非详尽。
**2. 定义后生元及生物活性成分研究的边界**
**2.1 定义后生元及其边界**
2021年ISAPP共识将后生元定义为“对宿主有益的无生命微生物和/或其成分的制剂”。该定义强调制剂而非任何微生物产生的物质，无生命微生物细胞或结构成分为基础，代谢物和加工中保留或释放的其他物质也可存在。这与更广泛的微生物产物和代谢物区分开。微生物代谢物（如短链脂肪酸（SCFAs）、有机酸、细菌素和胞外多糖（EPS））可能贡献宿主调节，但仅微生物来源不足以归类为后生元。纯化的单一化合物应视为后生元衍生的候选生物活性成分或效应分子。本综述将证据分为三组：符合ISAPP定义的后生元直接证据、从后生元制剂中分离或定量关联的组分证据，以及方法学或机制类似物（如培养上清、分泌组、活菌突变体和明确细菌配体）。
**2.2 后生元生物活性成分的主要来源**
后生元生物活性成分可来源于细胞壁和表面相关结构、胞外或可溶性因子，以及灭活或细胞裂解释放的胞内或裂解衍生成分。代表性成分包括肽聚糖（PGN）、壁磷壁酸（WTA）、脂磷壁酸（LTA）、表面蛋白、膜脂、短链脂肪酸（SCFAs）、有机酸、肽、细菌素、胞外多糖（EPS）、酶、核酸片段等。细胞包膜和表面相关结构因细胞位置明确且参与宿主识别而受到较多关注；可溶性和裂解衍生材料化学多样，丰度和可及性随培养和加工条件变化。这种分类有助于组织候选发现，但不建立成分对完整制剂活性的贡献。
**2.3 功能归因在后生元中的困难**
主要挑战不在于检测候选分子，而在于建立候选成分对复杂制剂活性的贡献程度。后生元本质上是多组分系统，结构成分、可溶性代谢物和裂解产物可能独立或联合作用。活性可能来自主导成分、多种成分的加和效应或分离后丧失的相互作用。活性组分或与强表型关联的分子特征提供有用线索，但不自动视为功能驱动因素。即使对于研究充分的细胞包膜结构，直接证据也常不完整。归因还因加工条件（菌株背景、培养、灭活、下游处理）而异，这些条件改变候选成分的保留、暴露、释放或转化。同一菌株的不同制剂在组成和活性上可能不同。活性还依赖于精细结构特征（如多糖架构、LTA组成、蛋白构象），而非仅成分类别或丰度。同一成分在不同实验系统中因受体表达、肠道微环境、炎症状态、剂量和终点而异。制备和测试条件的变异使跨研究比较困难，阻碍了后生元剂量标准的共同基础。研究应超越候选检测和关联，转向直接测试所选成分在原始制剂中的作用。
**3. 后生元生物活性成分的分子基础**
候选成分在位置、可及性、结构异质性和选择性干预可行性上不同，这些差异决定了可测量特征与生物活性关联的置信度。
**3.1 细胞壁和表面相关成分**
包括肽聚糖（PGN）、壁磷壁酸（WTA）、脂磷壁酸（LTA）、表面层蛋白、黏附素、菌毛相关成分和膜脂或糖脂。这些结构位于微生物包膜，其细胞来源和与宿主受体相互作用通常比胞内或裂解衍生成分更直接。PGN衍生的胞壁肽以结构依赖性方式被NOD1和NOD2识别。LTA与TLR2依赖性信号传导相关；去除或灭活LTA显著降低多种革兰氏阳性菌上清液的巨噬细胞刺激活性。表面蛋白活性受结构变异影响，如Lactobacillus kefiri的S层蛋白不同糖基化模式需要不同凝集素伙伴进行免疫刺激。纯化LTA的效应随剂量和模型变化。这些发现表明宿主反应不仅取决于一般成分类别，还取决于分子结构、剂量和实验背景。细胞包膜成分是合理的机制研究候选，但需将其存在和受体活性与源制剂联系起来。
**3.2 胞外分泌和可溶性成分**
包括短链脂肪酸（SCFAs）、有机酸、色氨酸衍生代谢物、维生素、细菌素、生物活性肽和胞外多糖（EPS）。这些分子在筛选研究中常被强调，可从无细胞组分中回收并通过代谢组学、蛋白质组学或化学方法分析。但该类别包括低分子量代谢物和较大大分子，在稳定性、纯化、结构表征和生物暴露上差异显著。这些成分与抗菌、免疫调节、屏障保护和代谢效应相关，但其对后生元制剂的贡献常受浓度、纯度、培养基背景、提取条件和与其他成分相互作用的影响。在分离或富集组分中观察到的活性不一定证明该成分是源制剂的主要贡献者。功能相关性应结合其实际丰度、结构状态和暴露情况解释。
**3.3 胞内和裂解衍生成分**
热处理、机械破碎等灭活程序可损伤细胞包膜，释放蛋白质、酶、肽、核酸片段和小分子，否则这些成分对宿主较不可及。灭活不仅改变微生物活性，还改变最终制剂的组成和可及性。但加工后成分的出现或增加不一定表明功能重要性，可能源于释放、降解或二次转化，其贡献随细胞破碎程度和加工条件变化。这些因素使裂解衍生成分难以跨研究比较，强调需区分加工诱导的可及性与已证明的生物贡献。
**3.4 对功能归因的启示**
三类来源及其代表性成分汇总于表1。该分类有助于组织候选成分，但不建立对完整制剂活性的贡献。其存在和可及性还取决于培养、灭活和下游加工，影响保留、暴露、释放或转化。下一节考察这些加工步骤如何塑造后生元组成并影响功能归因。
**4. 加工相关因素塑造后生元组成和候选可及性**
后生元成分谱是加工历史的产物。菌株和培养决定初始谱系，灭活和下游操作决定哪些分子保留细胞相关、暴露、进入可溶相或发生结构变化（图2）。
**4.1 菌株背景塑造初始成分谱**
后生元制剂中可用的成分主要取决于生产菌株。即使同一属或种，菌株在细胞包膜架构、表面蛋白谱、胞外多糖（EPS）产量、代谢能力和应激耐受性上可能差异显著，导致即使培养和加工条件相似也产生不同的组成和功能谱。食品来源的Lactiplantibacillus菌株的比较显示菌株依赖性的油酸水合酶序列、预测蛋白结构和共轭亚油酸产量差异。这些变异表现在EPS组成、分子量和分支，以及表面相关蛋白和代谢物谱。鉴定微生物至物种水平不足以进行有意义的比较，应记录菌株及其相关组成特征。
**4.2 培养条件建立灭活前组成**
菌株选定后，生长条件决定其潜在成分在灭活前的产生和积累。培养基成分、底物、pH、温度、氧气可用性和发酵模式可改变代谢物产量、EPS合成、细胞表面结构和应激反应。Lactiplantibacillus plantarum的研究显示，改变发酵底物或培养环境可修饰酚类释放、大分子结构和生物活性代谢物谱。培养的影响可能持续到生长后，因为细胞生理状态和组成可影响灭活中保留、暴露或释放的物质。可溶性成分的解释尤其困难，最终制剂中检测到的化合物可能由微生物产生、从培养基中残留或通过微生物转化培养基成分形成。因此应详细报告培养条件，并在残留或转化培养基成分可能影响组成分析时包括适当的培养基对照。
**4.3 灭活塑造成分保留、暴露、释放和结构**
培养过程中建立的组成在微生物灭活时进一步改变。热和非热处理可以不同方式和程度改变细胞包膜完整性、膜通透性、蛋白构象和表面理化性质。以前封闭在细胞内的成分可能释放，而包膜相关分子可能更可及而不脱离细胞表面。其他成分可能保持细胞相关或在处理中发生结构修饰和降解。这些变化由处理类型和强度共同决定，更剧烈的处理增加胞内释放和分子可及性，较温和的处理更好保留包膜架构和细胞相关结构。同一菌株的后生元制剂可含有不同比例的表面相关、可溶性和裂解衍生材料，即使灭活前组成相似。加工后成分表观增加不应解释为对生物活性贡献更强，可能反映细胞破碎、降解、转化或分析可及性改善。有意义的比较需清晰描述灭活方法、强度和其他操作条件。后续分离、浓缩、干燥和储存可能进一步改变成分回收、聚集、溶解性和可及性，细胞包膜碎片、胞外囊泡、蛋白质和多糖对脱水和重构敏感。因此下游加工条件应与培养和灭活一起考虑。
**5. 缩小和优先排序候选成分的实验策略**
寻找复杂后生元制剂中的生物活性成分通常从明确定义的表型开始，通过逐步排除不太可能的候选成分进行。活性基比较、分离、成分类别扰动、多组学分析和结构表征提供了不同但互补的减少组成复杂性和选择可管理候选成分的方法（图3）。没有单一方法足够，每种方法的结论取决于实验问题、所用对照和定量数据的可用性。
**5.1 后生元制剂的表型引导比较**
当比较的制剂显示出清晰且可重复的生物活性差异时，候选筛选更易解释。代表性例子是活菌与热灭活Akkermansia muciniphila的比较，热灭活保留或增强了多种代谢效应，将注意力转向加热后仍保持活性的细菌结构，支持后续对外膜蛋白Amuc_1100的研究。该比较信息丰富，因为菌株不变而加工状态不同。Amuc_1100重现了部分效应，但未确定该蛋白对完整制剂活性的贡献。类似逻辑应用于不同加热条件的制剂，如70-121°C处理10分钟，活性和结构变化相关。比较需样本在一个主要明确定义的特征上不同，目标表型和评估时间点预先选定，以等效剂量和相同归一化基础测试，大且可重复的对比更有用。此类比较帮助选择后续分离和分子分析的样本，但负责成分的身份和贡献仍需在后续实验中建立。
**5.2 候选成分的活性引导分离**
活性引导分离将复杂后生元制剂分为更简单的组分，并使用一致生物测定确定活性保留的位置。分离基于分子大小、极性、溶解度、电荷等理化性质，常用超滤、溶剂分配、沉淀和色谱。每个组分应与未分离制剂比较，使用追踪至相同起始材料量的剂量，并记录材料回收率和生物活性回收率。否则强活性可能仅源于加工中的浓缩。Akkermansia muciniphila免疫调节磷脂的分离展示了该方法：从细菌细胞沉淀中提取脂质，经正相色谱和反相HPLC逐步分离，结合TNF-α诱导活性测定，定位至磷脂酰乙醇胺15:0-i15:0 PE。重复分离和活性追踪将复杂脂质提取物减少为结构明确的候选。但分离程序可能改变材料，需溶剂和过程对照，以及步骤中材料损失评估。重组组分可显示原始活性是否恢复或依赖于分离中分离的相互作用。活性引导分离可将活性定位至较窄理化范围并提供可处理的候选，但证明单个分子对原始制剂活性必要需后续成分特异性实验。
**5.3 选择性去除和类别级贡献测试**
选择性去除回答不同问题：减少或禁用明确成分或成分组是否改变原始制剂活性。分离将活性跟随至分离组分，而丧失功能方法测试去除或禁用目标的效果。三种方法应区分：化学或酶促类别级去除、分子特异性免疫去除和灭活前基因消除成分生产。化学或酶处理（如蛋白酶消化、中和）通常测试广泛成分类别，可指示蛋白质或肽贡献，但不揭示具体分子。免疫去除提供更特异性测试，如用抗体去除p40和p75，减少Akt激活并逆转细胞保护。基因消除阻止微生物在制剂制备前产生候选，如缺失LTA生物合成基因，显示突变体与亲本菌株免疫学效应不同。所有方法需证据表明目标减少或消除而未引起制剂其他部分重大变化，适当对照包括模拟或试剂处理、非特异性抗体对照和匹配野生型菌株。活性下降不证明目标唯一负责，因不完全去除、脱靶效应、遗传变化和成分间相互作用可能影响响应。证据最强时是丧失活性后以原始制剂中测量的浓度进行重组。
**5.4 多组学鉴定和基于关联的优先排序**
一旦活性定位于特定样本、组分或成分类别，多组学分析可帮助确定哪些分子值得进一步研究。平台选择应反映可疑候选的理化性质：代谢组学用于小分子（有机酸、氨基酸衍生物、短肽、胺、核苷酸等），脂质组学用于膜脂和糖脂，蛋白质组学和表面蛋白质组学用于胞外、表面相关或裂解暴露蛋白，多糖需不同分析路线（分子量、单糖组成、分支、连接模式等）。相关特征可根据与目标表型的紧密程度排序，如Fonseca等比较免疫调节活性差异的益生菌培养上清代谢组学谱，识别出区分活性上清的色氨酸代谢特征。但相关、回归和网络分析只能排列优先顺序，因分子可能共变。重复关联提供更强优先排序依据，但仍不足功能归因，需针对原始制剂的靶向实验。
**5.5 优先候选的结构表征**
候选池缩小后，所选成分需充分表征以确定实际测试材料，包括分子身份和纯度，以及物理形式。仅分子名称通常不足，尤其对于异质性候选（如EPS、PGN片段、LTA、膜脂、微生物蛋白）。同一名义类别的成员可能在分子量、取代模式、酰基链组成、构象、聚集状态或与其他细胞结构关联上不同，改变生物效应。分析要求因候选类型和复杂性而异：MS、MS/MS和NMR支持分子身份和结构分配，色谱和光散射方法描述分子量分布和组成异质性，光谱方法（FTIR、拉曼）提供补充信息，显微镜评估细胞形态。复杂候选通常需多种分析技术。充分表征使候选可量化、跨制剂比较并在后续实验中重现测试。表征本身不能显示成分对源制剂生物活性的贡献。表2总结了表型引导比较、活性引导分离、类别级去除、多组学优先排序和结构表征的作用、设计要求和解释限制，共同提供从复杂制剂到明确定义候选的实用路线。
**6. 优先候选的功能验证和证据评估**
**6.1 候选特异性去除和重组**
一旦候选被优先排序并充分表征，下一个问题是其对原始后生元制剂活性的可测量贡献。最直接设计包括未处理制剂、模拟处理制剂、候选去除制剂和去除后添加回补候选的制剂。去除效率需量化，并监测非目标成分的可能变化。选择性去除后活性下降，随后以内在浓度恢复候选后活性恢复，提供比单独测试纯化候选强得多的贡献证据。目前很少有后生元研究完成完整去除-重组序列。常见候选（如Amuc_1100、P9、LTA）重现了源菌或制剂的部分效应，但未选择性去除和重组，因此贡献程度未解决。重组实验中的恢复程度需结合去除效率、未处理制剂活性和重组候选的剂量与物理形式考虑，部分恢复可能指示不完整恢复、分子呈现改变或依赖于多种成分共同作用的响应。
**6.2 剂量-反应关系和制剂相关暴露**
剂量-反应实验更易解释，当纯化候选的测试剂量与其在原始制剂中的测量含量比较时。关键问题不仅在于候选是否随剂量增加而活跃，还在于制剂是否含有足够量产生观察到的响应。需靶向或绝对定量，然后以制剂递送的等效浓度测试。例如，EPS在感染Helicobacter pylori的小鼠中测试，较高剂量产生更大改善，但未显示细菌制剂能否递送等量EPS。LTA的免疫调节活性随剂量和炎症状态变化，表明免疫活性成分可能在不同条件下表现不同，不产生简单线性剂量-反应关系。给药途径、分子形式和周围基质也影响到达生物靶标的剂量。纯化分子在溶液中可能不同于细胞表面附着、聚集或掺入食品基质时的行为。消化可进一步改变结构和可用性。可重复的剂量-反应关系支持候选的生物相关性，尤其当活性发生在制剂中存在的浓度附近，但不取代对原始制剂活性的直接测试。
**6.3 机制干预和靶标参与**
机制支持应区分通路关联与通路依赖性。受体丰度、磷酸化状态或下游基因表达的变化表示信号通路被激活，但不建立通路对候选诱导表型的必要性。更强证据来自抑制、基因沉默、受体缺失或丧失功能突变减弱效应，尤其当直接候选-靶标相互作用也展示时。Bae等显示Akkermansia muciniphila磷脂a15:0-i15:0 PE的免疫调节活性需要TLR2-TLR1异二聚体，结构类似物用于定义信号所需分子特征。Gao等提供更强通路级证据，显示肽聚糖水解酶LPH的保护效应在NOD2缺陷小鼠中丧失，将酶促生成MDP与NOD2依赖性肠道保护联系起来。Amuc_1409与E-cadherin相互作用，促进E-cadherin/β-catenin复合物解离并激活Wnt/β-catenin信号，肠道干细胞中E-cadherin缺失消除其再生效应。这些研究表明当受体参与和表型依赖性直接展示时，机制得到更好支持。但强靶标级证据本身不建立候选对源后生元制剂活性的贡献，应结合制剂级去除、剂量相关性和体内证据解释。
**6.4 跨模型验证和生理相关性**
当同一充分表征的候选在递增生物学复杂性的模型中产生相关效应时，证据更令人信服。无细胞或细胞基测定揭示直接分子和细胞响应，动物研究额外考虑递送、稳定性、组织暴露、代谢和与肠道环境的相互作用。跨模型终点应保持生物学连接，使结果解释为同一潜在效应的证据。Lacticaseibacillus rhamnosus GG蛋白HM0539增加黏蛋白和紧密连接蛋白表达，限制LPS或TNF-α诱导的屏障破坏，口服给药改善新生大鼠和DSS结肠炎小鼠的肠道屏障结局。Lactocepin纯化酶降解促炎趋化因子IP-10，其编码基因prtP破坏降低源菌的抗炎活性。一致的生化、细胞和动物发现增加候选在生理相关条件下作用的信心，也帮助识别限于特定测定或模型的效应。但跨模型活性不建立候选对定义后生元制剂的贡献，例如Lactocepin研究展示活菌中功能丧失而非灭活制剂。制剂级归因仍需在后生元中测量候选，随后在可能情况下进行选择性去除和相关剂量添加回补。
**6.5 整合证据进行功能归因**
没有单一实验能完全确定候选是否解释后生元制剂部分活性。去除和重组实验测试其在制剂内的贡献，剂量-反应研究确定其是否以实际存在的量和物理形式保持活性，靶向通路干预建立所需受体或信号通路，跨模型研究检查效应是否在更生理相关条件下持续。这些方法共同解决贡献、剂量相关性、机制和生物学有效性。为评估当前研究满足这些要求的程度，代表性原始研究在制剂定义、候选鉴定和定量、选择性去除、重组、剂量相关性、机制干预和体内支持方面进行评估（表3）。使用五个证据类别：提议候选、活性相关候选、类别级贡献、候选特异性功能支持和制剂锚定贡献。评估的15项研究中，1项报告提议候选，3项识别活性相关候选，1项支持成分类别，10项提供候选特异性功能支持，无一项满足制剂锚定贡献标准。这些研究支持许多候选的活性和机制合理性，但很少显示其对完整制剂表型的贡献程度。一些制剂级效应也不大可能来自单一成分，类别级扰动后残留活性、去除后不完全丧失或多个组分中检测到活性可能指向多成分贡献，但本身不是协同证据。若一个候选仅解释部分表型，应以制剂相关比例测试定义组合并评估加和模型。
**7. 功能归因的当前局限和未来方向**
研究已鉴定众多微生物蛋白、多糖、细胞壁成分、脂质、代谢物和囊泡相关因子具有生物活性。但如表3所示，候选鉴定的进展已超过确定其对完整后生元制剂贡献的努力。主要困难不再是发现潜在活性分子，而是建立每个候选存在多少、以何种物理形式存在以及是否对制剂级表型有可测量贡献。
**7.1 候选活性与制剂级归因之间的证据差距**
通过比较组学或活性引导分离选择的候选常作为纯化或重组分子测试。Amuc_1100、热灭活Lacticaseibacillus paracasei D3-5相关的LTA和Akkermansia muciniphila磷脂a15:0-i15:0 PE在细胞或动物模型中重现了特定效应，但均未结合从源材料中选择性去除和以制剂中含量添加回补。候选在源制剂中的浓度很少测量，纯化可能改变分子组织、可及性或有效暴露。这些变量与制剂生产和处理密切相关，应报告菌株、培养基、生长条件、灭活、下游加工、储存条件和最终基质，以及归一化基础（如干重、细胞当量）。当候选丰度测量时，可将测试制剂剂量递送的候选量与纯化候选剂量直接比较。候选定量应为后续去除和重组实验提供基础。
**7.2 结构异质性和实验背景导致不一致发现**
同一名称下的成分可能在不同研究中产生不同甚至相反效应。
