MCL1通过糖酵解重编程诱导的H4K12乳酸化促进内皮细胞衰老和动脉粥样硬化

《International Journal of Molecular Sciences》：MCL1 Promotes Endothelial Senescence and Atherosclerosis via Glycolytic Reprogramming-Induced H4K12 Lactylation

　　

衰老内皮细胞（ECs）的积累加速动脉粥样硬化，然而在EC衰老过程中将代谢失调与表观遗传重编程联系起来的分子调控因子仍然不明。在此，研究人员研究了髓细胞白血病1（MCL1）在内皮衰老和动脉粥样硬化发生中的具体作用。通过整合生物信息学分析，MCL1被鉴定为候选衰老调控因子。在人类颈动脉粥样硬化斑块、ApoE^?/?小鼠以及多种EC衰老模型（主要是HRAS^G12V诱导的衰老人脐静脉内皮细胞（HUVECs））中验证了MCL1的表达。在HUVECs中进行了功能缺失和获得实验。利用Seahorse细胞外通量分析、乳酸测量、免疫共沉淀（Co-IP）和CUT&Tag测序探索了潜在的代谢和表观遗传机制。通过在高脂饮食喂养的ApoE^?/?小鼠中进行AAV介导的MCL1敲低，评估了体内治疗潜力。MCL1表达在动脉粥样硬化斑块和衰老ECs中显著上调。功能上，MCL1敲低减弱了衰老标志物（SA-β-gal、P21），抑制了衰老相关分泌表型（SASP），并恢复了细胞增殖，而MCL1过表达则加剧了EC衰老。机制上，MCL1促进了糖酵解重编程和细胞内乳酸积累。这种代谢副产物作为组蛋白H4K12乳酸化（H4K12la）的表观遗传底物，该修饰特异性富集于CDKN1A（P21）启动子，与其转录相关。在体内，AAV介导的MCL1沉默有效降低了血管H4K12la水平，减轻了血管衰老，并显著限制了动脉粥样硬化病变面积。研究人员的研究发现，MCL1通过涉及糖酵解重编程、乳酸积累和H4K12la相关的P21上调的代谢-表观遗传机制，成为内皮衰老和动脉粥样硬化的关键调控因子。这些发现表明，靶向MCL1相关通路可能代表一种潜在的治疗动脉粥样硬化的策略。

**研究背景与问题**
动脉粥样硬化是一种动脉壁慢性炎症性疾病，是心肌梗死、缺血性卒中和外周动脉疾病等主要心血管事件的根本病理基础。尽管降脂治疗、抗血小板药物和介入技术取得了显著进展，动脉粥样硬化性心血管疾病仍是全球发病率和死亡率的主要原因，凸显了阐明动脉粥样硬化发生新分子机制和识别新治疗靶点的紧迫性。血管内皮是循环血液与动脉壁之间的动态界面，调控血管张力、通透性、凝血和炎症反应，内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化发生的最早事件。细胞衰老驱动内皮功能障碍，加速血管衰老和动脉粥样硬化。衰老内皮细胞在斑块内积累，表现出不可逆的细胞周期停滞、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（P21和P16）表达上调、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加以及促炎性分泌表型（SASP）。清除衰老细胞或阻断衰老表型已在临床前模型中减轻动脉粥样硬化，但动脉粥样硬化微环境中启动和维持内皮衰老的上游分子调控因子仍不完全清楚。髓细胞白血病1（MCL1）是BCL-2蛋白家族的抗凋亡成员，除经典抗凋亡功能外，新证据表明MCL1参与调节线粒体形态、嵴组织、氧化磷酸化和细胞生物能量学，甚至可直接与己糖激酶2（HK2）相互作用促进糖酵解。代谢重编程是细胞衰老的标志，衰老细胞通常转向更高糖酵解并产生乳酸。乳酸被发现作为组蛋白赖氨酸乳酸化（Kla）的新型表观遗传修饰底物，将细胞代谢与基因表达直接联系。然而，MCL1是否通过糖酵解重编程驱动内皮衰老，以及组蛋白乳酸化是否参与内皮衰老和动脉粥样硬化，尚待探索。

**研究内容与结论**
研究人员通过整合转录组学、衰老相关和线粒体基因数据库的生物信息学分析，鉴定MCL1为动脉粥样硬化中内皮衰老的先前未被认识的调控因子。在人类颈动脉粥样硬化斑块、ApoE^?/?小鼠主动脉和衰老诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中证实MCL1上调。体外功能缺失和获得实验表明，MCL1敲低减弱衰老标志物和SASP，恢复增殖；MCL1过表达则诱导衰老。体内通过AAV介导的MCL1敲低，有效减轻ApoE^?/?小鼠动脉粥样硬化病变面积，减少内皮衰老。机制上，MCL1促进糖酵解重编程和乳酸积累，乳酸作为组蛋白H4K12乳酸化（H4K12la）的底物，特异性富集于CDKN1A（P21）启动子，激活P21转录。在体内，MCL1敲低降低血管H4K12la水平。研究揭示MCL1驱动的代谢-表观遗传轴调控内皮衰老和动脉粥样硬化，靶向该轴可能成为治疗策略。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**关键技术与方法**
研究人员采用了整合生物信息学分析，交叉分析动脉粥样硬化相关数据集GSE283095、CellAge衰老数据库和MitoMiner线粒体蛋白数据库。临床样本来自复旦大学附属中山医院青浦分院行颈动脉内膜剥脱术的严重颈动脉狭窄患者（n=7）。动物模型为8周龄雄性ApoE^?/?小鼠（C57BL/6背景），高脂饮食喂养12周，尾静脉注射scAAV2/9-shRNA进行MCL1敲低。细胞模型为HRAS^G12V诱导的HUVEC衰老模型及氧化应激（TBHP）诱导模型。主要技术包括：Seahorse细胞外通量分析（线粒体呼吸和糖酵解速率）、乳酸测定、免疫共沉淀（Co-IP）、CUT&Tag测序（H4K12la全基因组分布）、免疫荧光、Western blot、实时定量PCR（qRT-PCR）、SA-β-gal染色、EdU掺入实验、油红O染色等。

**研究结果**
**2.1 MCL1在动脉粥样硬化斑块和衰老内皮细胞中显著上调**
通过整合生物信息学（Venn图）从GSE283095、CellAge和MitoMiner数据库交集鉴定MCL1为候选基因。STARNET数据库分析显示，冠心病患者动脉粥样硬化主动脉中MCL1 mRNA表达显著升高。人类颈动脉斑块免疫荧光和Western blot证实，斑块核心区域CD31⁺内皮细胞中P21和MCL1蛋白表达增加。ApoE^?/?小鼠主动脉免疫荧光和Western blot显示高脂饮食后内皮衰老和MCL1表达同步升高。HRAS^G12V诱导的HUVEC衰老模型中MCL1蛋白表达上调。

**2.2 MCL1是内皮细胞衰老的关键调控因子**
在HRAS^G12V诱导的衰老HUVECs中，siRNA敲低MCL1后，SA-β-gal阳性细胞比例降低，P21蛋白和SASP mRNA（IL1β、IL6、ICAM1、CCL2）水平下降，EdU掺入增加（增殖恢复）。在TBHP诱导的氧化应激衰老模型中，MCL1敲低同样减弱衰老表型。相反，MCL1过表达足以诱导正常HUVECs衰老（SA-β-gal增加、P21和SASP上调、增殖受损）。

**2.3 AAV介导的MCL1敲低减轻体内动脉粥样硬化和内皮衰老**
在ApoE^?/?小鼠中，AAV-shMCL1尾静脉注射后，Western blot证实主动脉P21蛋白表达降低。油红O染色显示，全主动脉和主动脉根部横切面病变面积显著减少。免疫荧光显示，CD31⁺内皮区域MCL1表达降低，P21⁺衰老内皮细胞数量减少。

**2.4 MCL1调节衰老HUVECs的代谢重编程**
Seahorse分析显示，衰老HUVECs的耗氧率（OCR）降低（基础呼吸、ATP产生、备用呼吸容量、最大呼吸均下降），MCL1敲低恢复这些参数；MCL1过表达则抑制OCR。糖酵解速率测定显示，衰老HUVECs的质子外排率（PER）、基础糖酵解和代偿性糖酵解升高，MCL1敲低逆转；MCL1过表达增强糖酵解。乳酸测定表明MCL1敲低减少乳酸生成。进一步机制研究发现，MCL1敲低选择性降低PFKP蛋白表达，Co-IP提示MCL1与PFKP存在潜在相互作用，免疫荧光显示两者共定位。

**2.5 MCL1通过乳酸积累促进HUVEC衰老**
外源乳酸钠（NaLa，10 mM，24 h）处理可逆转MCL1敲低的抗衰老效果：恢复SA-β-gal阳性、P21蛋白和SASP mRNA表达，消除EdU掺入恢复。糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，2 mM，24 h）处理衰老HUVECs，显著减少SA-β-gal阳性、降低P21和SASP、增加EdU掺入。特异性敲低LDHA同样重现2-DG的抗衰老效果（P21降低、SA-β-gal减少、增殖恢复、SASP抑制）。

**2.6 MCL1通过H4K12乳酸化促进HUVEC衰老**
Western blot显示，衰老HUVECs中总蛋白泛乳酸化（pan-Kla）水平升高，MCL1敲低消除该升高；MCL1过表达增强pan-Kla。检测多种特异性组蛋白乳酸化位点，仅H4K12乳酸化（H4K12la）在衰老细胞中显著升高，且被MCL1敲低降低，其他位点（H4K16la、H4K8la、H4K5la、H3K18la、H3K14la、H3K9la）无显著变化。CUT&Tag测序分析显示，外源乳酸处理使HUVECs中H4K12la在转录起始位点（TSS）附近全基因组富集增加，KEGG通路富集分析显示乳酸诱导H4K12la沉积的基因显著富集于“细胞衰老”通路。可视化显示CDKN1A（P21）启动子区域H4K12la峰在乳酸处理组显著高于对照组。

**2.7 AAV介导的MCL1敲低降低动脉粥样硬化小鼠内皮H4K12la**
免疫荧光染色显示，AAV-shMCL1处理的ApoE^?/?小鼠主动脉CD31⁺内皮细胞中H4K12la水平显著低于AAV-vector对照组。

**讨论与结论**
讨论部分指出，MCL1在人类和小鼠动脉粥样硬化病变以及多种衰老模型中表达升高，功能实验表明MCL1对内皮衰老表型的建立和维持既是必要的也是充分的。体内MCL1敲低减轻斑块负担，提示MCL1在疾病进展中起因果作用。机制上，MCL1通过促进糖酵解和乳酸积累，提高H4K12la在P21启动子的富集，激活P21转录，形成代谢-表观遗传环路。但研究存在局限性：临床样本量小且缺乏结局数据；AAV载体非严格内皮特异性；未直接证明MCL1-H4K12la-P21的因果线性；未评估凋亡标志物和更多衰老标志物；MCL1与PFKP的相互作用机制未完全阐明。研究结论（翻译）：总之，研究人员的研究表明，MCL1通过增强乳酸产生和H4K12la沉积，最终与P21激活相关，从而促进内皮细胞衰老和动脉粥样硬化。这些发现不仅扩展了研究人员对血管衰老中代谢与表观遗传相互作用的理解，而且表明靶向MCL1可能代表一种减轻内皮细胞衰老和动脉粥样硬化性心血管疾病的新机制范式。未来需使用更特异的内皮靶向工具和更大临床队列来验证该通路及其转化潜力。