球孢白僵菌表达蜘蛛来源Hv1a神经毒素增强对刺吸式害虫的生物防治效力

《Agronomy》：Engineering Beauveria bassiana with Spider-Derived Hv1a Neurotoxin Enhances Biocontrol Efficacy Against Piercing–Sucking Insect Pests

　　

昆虫病原真菌如球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是重要的生物防治因子，可作为化学杀虫剂的替代方案；然而其应用常受致死速率相对较慢的限制。本研究研究人员利用芽生孢子介导的LiAc/PEG转化系统构建了Bb2860菌株的重组株Bb2860-Hv1a以表达蜘蛛来源神经毒素基因Hv1a，并通过PCR与Western blot分析进行确认。重组真菌在宿主感染后重新分离仍保留可检测的Hv1a表达。Hv1a表达在实验室条件下不影响菌落生长或分生孢子产量。采用不同感染途径的生物测定显示，Hv1a表达对杀虫活性的影响因昆虫种类与实验条件而异。Bb2860-Hv1a在浸渍测定中对大蜡螟（Galleria mellonella）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）及亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）幼虫无显著增效，但在血腔注射测定中将O. furnacalis幼虫LT50从5.20天缩短至4.15天。叶面喷雾测定中，相较于野生型，Bb2860-Hv1a对棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）、西花蓟马（Frankliniella occidentalis）和烟粉虱（Bemisia tabaci）致死率提升，最终死亡率分别为62.22%、68.89%、60.00%和95.56%，LT50分别为4.86、5.61、5.92和4.87天。综上，Hv1a表达可在特定生物测定条件下增强球孢白僵菌杀虫活性，尤其针对喷雾施用的若干刺吸式害虫。本研究为进一步评估和优化Hv1a表达球孢白僵菌作为潜在真菌生物防治候选菌株提供依据。

研究背景方面，昆虫病原真菌如球孢白僵菌（Beauveria bassiana，一种广泛应用的昆虫寄生真菌）因其可持续特性成为化学农药的重要替代，但致死速度慢与环境胁迫敏感两大瓶颈制约其田间推广。传统育种与发酵优化增益有限，分子水平工程化改造成为补充路径。蜘蛛毒液中的ω-ACTX-Hv1a（简称Hv1a，一种靶向昆虫电压依赖性钙通道的ω-agatoxin）对昆虫高选则、对脊椎动物低毒，已在绿僵菌（Metarhizium）等系统中展现增效潜力，但在球孢白僵菌中及不同接种方式下的系统评估尚不充分。研究人员因此将Hv1a引入球孢白僵菌Bb2860，旨在明确异源表达是否增强杀虫活性及条件依赖性。

主要关键技术方法方面，研究人员以球孢白僵菌ARSEF 2860（Bb2860-WT）为亲本，将融合球孢白僵菌几丁质酶信号肽Bbsp的Hv1a编码序列克隆至pAN52-TEF1-3×FLAG-SUR载体，经XhoI线性化后，采用芽生孢子（blastospore，菌丝液体培养产生的酵母态细胞）介导LiAc/PEG法转化Bb2860，筛选氯嘧磺隆抗性转化子，以PCR与抗FLAG抗体Western blot验证整合与表达，并连续传代评估遗传稳定性。生物测定涵盖浸渍、血腔注射（100 nL，1×10⁶ 分生孢子 mL^-1）及叶面/体壁喷雾（1×10⁸ 分生孢子 mL^-1）三种途径，试虫包括大蜡螟、亚洲玉米螟、斜纹夜蛾幼虫，以及棉蚜、桃蚜若虫、西花蓟马若虫、烟粉虱Q型成虫，种群分别源自河北保定棉田、贵州遵义烟田、湖北农科院长期实验室种群及北京2003年西花蓟马种群等。

研究结果部分，3.1节载体与转化子构建中，研究人员通过同源重组获得8051 bp重组质粒pAN52-TEF1-3×FLAG-SUR-BspHv1a，芽生孢子转化获16个PCR阳性转化子，Western blot在约10 kDa处检出Hv1a-3×FLAG融合蛋白，选高表达株Bb2860-Hv1a。3.2节生物学特性与稳定性中，Bb2860-Hv1a与野生型在PDA上7日菌落直径（2.78对2.73 cm）、分生孢子产量（10.02×10⁸对9.70×10⁸ mL^-1）无显著差异，非选择培养基传10代后PCR仍检出500 bp整合片段，表明生长与遗传稳定性未受扰。3.3节毒力测定显示：对G. mellonella浸渍LC₅₀与LT₅₀均无显著差异，死虫再分离株经PCR/Western blot确认Hv1a存留；对O. furnacalis浸渍无增效，但血腔注射LT₅₀由5.20降至4.15天（约降20%）；对S. litura浸渍终死亡率升高（63.33%对43.33%）但生存曲线与LT₅₀不显著；喷雾下对A. gossypii（LT₅₀ 4.86天，终死亡率62.22%对28.89%）、M. persicae（5.61天，68.89%对48.89%）、F. occidentalis（5.92天，60.00%对37.78%）及B. tabaci成虫（4.87天，95.56%对68.89%）均显著提速增效，野生型在多组中7日内未达50%死亡。

讨论部分指出，Hv1a增效具生物测定依赖性：注射绕开附着穿透屏障直接入血腔方显神经毒贡献，浸渍受 Cuticle（体壁）穿透与宿主免疫限制，故鳞翅目幼虫浸渍不增效；喷雾使刺吸式害虫体壁薄、接触面积大，毒素早期暴露更充分。随机整合可能带位置效应，单克隆结论需多独立转化子复证。启动子（如PBbgpd）与表达框优化、联用_cuticle-degrading enzymes（体壁降解酶）是后续方向。田间适应性、非靶标安全性与生态适合度待评。

结论部分翻译如下：总之，本研究利用芽生孢子介导转化系统在球孢白僵菌Bb2860中成功表达蜘蛛来源神经毒素Hv1a。重组株Bb2860-Hv1a保留可检测Hv1a表达，且在测试实验室条件下对菌落生长或分生孢子产量无明显影响。生物测定表明Hv1a表达在特定实验条件下增强球孢白僵菌杀虫活性：血腔注射将O. furnacalis幼虫LT₅₀由5.20降至4.15天，提示Hv1a介导神经毒性在毒素入血腔时可促死；喷雾对多种刺吸式害虫增效明显。Hv1a效应随虫种与接种途径变化，属受宿主特征、感染进程与递送效率影响的生物测定依赖模式。Bb2860-Hv1a田间效力、环境稳定性、非靶标安全性与长期生态适合度需进一步研究。本研究为评估和优化Hv1a表达昆虫病原真菌作为潜在生物防治剂奠定基础。论文发表于《Agronomy》。