《Fermentation》：A Review on Modeling the Fermentation Process of Dairy Products Using Multi-Omics and Artificial Intelligence Approaches
在乳制品生产中，发酵过程是一个复杂的生化系统，对最终产品的质量标准的确定起着重要作用。传统的发酵控制方法依赖于有限且非标准的工艺参数。近年来，组学技术凭借其当前、高效且可靠的方法，已经走上前沿，使得能够在分子水平上监测发酵动态。得益于代谢组学（metabolomics）、宏基因组学（metagenomics）、蛋白质组学（proteomics）和脂质组学（lipidomics）等组学方法，发酵过程中的发酵剂培养物行为、代谢物形成、香气-质地形成以及微生物相互作用可以更全面地被表征。另一方面，使用传统统计方法评估或计算高维组学数据是一个挑战。人工智能应用正在克服这一挑战，为数据的准确可靠评估提供了重要机遇。人工智能驱动的模型在预测发酵动力学、过程控制、优化质量标准以及通过代谢物揭示产品治疗潜力等领域具有前景。本综述旨在全面阐述当前利用多组学技术和人工智能应用对乳制品发酵过程和质量参数进行建模的方法。在这方面，它将为工业应用和未来研究提供当前且重要的视角。
1. 引言
发酵食品是人类饮食中不可或缺的一部分，但如今随着消费者对健康生活意识的提高，对发酵产品的兴趣进一步增加。发酵是一种基本的生物技术过程，已用于保存食品、创造新风味以及通过利用微生物的代谢活动赋予健康益处长达数世纪之久。在发酵过程中，底物被微生物转化为细胞能量、生物质和代谢物，最终产品的整体质量在很大程度上由这些释放的代谢物塑造。
在所有传统或现代生物技术过程中，发酵的成功直接取决于所用底物的质量。牛奶以其高蛋白质含量和丰富的营养价值，成为这些系统的宝贵食品。牛奶丰富的营养基质对进行发酵的微生物的最佳发育起着关键作用。发酵是保护牛奶和乳制品（其在结构上极易腐败）免受微生物腐败并安全延长产品保质期的最基本生物技术方法之一。此外，牛奶发酵过程中使用的技术和基础设施要求不需要非常高的成本，使得该方法在工业规模上经济且可持续。牛奶是富含蛋白质的来源，含有人类健康必需的氨基酸和生物活性肽。当这种宝贵的蛋白质基质进行乳酸发酵时，研究人员发现，由于过程中的酶活性，与未发酵的版本相比，牛奶的消化率显著提高。
发酵是益生菌微生物发酵益生元成分的过程，导致释放对健康有积极影响的益生后代谢物。益生菌和益生元之间的共生相互作用机制增强了这些成分在胃肠系统中的生物利用度，从而改善了最终产品提供的健康益处。益生后代谢物修复肠道中的上皮组织并调节免疫代谢。它还表现出抗炎、抗氧化和抗肿瘤特性。
发酵乳制品，其在食品科学和营养学文献中最流行的例子包括酸奶、开菲尔、发酵乳、酸奶油和特定类型的奶酪，当作为饮食的一部分食用时，在人体生理学中提供关键的改善。在此背景下，强调定期食用这些产品通过显著增加个体的饱腹感、通过优化胃肠功能改善整体肠道健康、有助于改善胰岛素敏感性（代谢失衡之一）以及调节脂质代谢等机制，为人类健康提供多方面的整体益处。
因此，本综述提供了牛奶发酵的生物学基础、通过组学技术生成分子信息、整合异质多组学数据集的策略，以及最终在评估多组学数据中基于人工智能的预测模型。此外，通过强调提高人工智能模型可解释性的可解释人工智能方法，本综述作为叙事性文献综述，提出了优化牛奶发酵动态的策略和当前挑战，并展望了未来。在搜索相关研究时，利用了Web of Science、Scopus和PubMed等数据库，并使用诸如“乳制品发酵”、“发酵动力学”、“多组学方法”、“代谢组学”、“宏基因组学”、“转录组学”、“蛋白质组学”、“多组学数据整合”、“机器学习”、“深度学习”、“可解释人工智能”和“数字孪生”等关键词组进行搜索。
2. 牛奶发酵的微生物学基础
已知牛奶发酵的主要驱动力是微生物的代谢活动，这种活动导致各种生化过程，包括碳水化合物、蛋白质和脂质转化为各种代谢物。此外，这些活动塑造了产品的质量、营养价值、安全性和功能特性。因此，理解牛奶发酵背后的微生物群落是揭示该生化过程中涉及的分子机制的第一步。
成功和标准化的发酵食品生产需要指导过程的具体起始培养物。在选择整合到工业过程中的起始培养物时，技术因素如对人类食用的安全性、通过降低环境pH加速过程的酸化速率以及改善最终产品结构特性的胞外多糖（EPS）生产能力至关重要。
起始培养物选择过程中的另一个重要技术参数是半乳糖代谢。半乳糖在最终产品中的积累从生产者和消费者的角度来看都是绝对不可取的，因为它可能导致感官缺陷；因此，优选微生物在反应链中成功代谢并消耗半乳糖对于维持产品质量至关重要。
在乳制品发酵中工业使用的大多数菌株属于乳酸菌（LAB）群。基本上定义为通过发酵将葡萄糖转化为乳酸的革兰氏阳性（+）非产芽孢微生物，LAB群在增强牛奶的特定香气、结构特性和整体最终质量方面起着关键作用。尽管这些细菌可以作为一些传统乳制品基质中的天然菌群元素存在，但它们通常以起始培养物的形式从外部引入过程，以确保工业生产标准。历史上归类于乳酸杆菌属的物种，现已分为各种新属，构成了LAB群中最大的分类单元，其次是链球菌属和乳球菌属，这些在乳制品技术中非常重要。
在过去应用的发酵过程中，当微生物动态尚未被完全理解时，环境温度条件是指导微生物生长的主要参数。作为依赖于最适生长温度的适应过程，观察到嗜热（30–45°C）LAB菌株在环境温度高的国家占主导地位，而嗜温（20–30°C）LAB菌株在寒冷气候带的国家发育。这种区域温度差异以及由此引起的微生物菌群变化导致细菌产生的代谢物分化，从而为最终产品感官特性和特征风味的结构变化创造了基础。作为其代谢活动的一部分，LAB群利用其特定酶水解环境中的蛋白质、脂质和碳水化合物。这些反应的结果是，这些大分子被分解为肽、游离氨基酸、游离脂肪酸和乳酸，还原为具有高生理消化性的亚基。牛奶成分的代谢途径及其对产品质量的影响如图1所示。
根据代谢途径分为同型发酵和异型发酵两个主要类别的LAB，在其终产物谱方面有所不同。同型发酵群包括片球菌属、链球菌属和乳球菌属等属，作为葡萄糖发酵的结果，仅产生乳酸作为主要代谢物。相比之下，异型发酵群包括魏斯氏菌属和明串珠菌属等属，代谢葡萄糖，释放乳酸以及乙醇和二氧化碳（CO2）。发酵乳生产基于所选培养物降低牛奶的pH引起凝固，或增加其酸度而不引起凝固的原理。随着酸度的增加，环境中除LAB群以外的微生物由于低pH和有机酸积累而受到竞争性抑制，并失去活力。所选菌株的特征差异，如活细胞数和发酵时间，不仅引起发酵乳的风味和香气特征变化，还引起其代谢物的变化。
2.1. 香气和质地发展
LABs的香气相关活动是物种依赖性的，一些特定活动仅在少数物种中发现。一个例子是支链α-酮酸脱羧酶活性，该酶能够从支链氨基酸形成麦芽样的支链醛，仅在乳酸乳球菌中发现。这些细菌还在形成特定香气化合物双乙酰和乙偶姻中发挥积极作用。在所检查的乳酸杆菌和明串珠菌菌株中未检测到支链α-酮酸脱羧酶活性。然而，双乙酰、乙酸和乙醇产量依赖于明串珠菌属而增加。以产生特定奶酪香气而闻名的细菌费氏丙酸杆菌谢氏亚种和亚麻短杆菌也在奶酪质地（结构特性）中发挥积极作用。
发酵乳制品中香气的形成本质上是一个复杂的多因素过程，而不是单一微生物物种或代谢途径的结果。在这里，碳水化合物代谢提供中心中间体如丙酮酸以及有机酸，而蛋白质水解通过将产生的肽和游离氨基酸转化为各种化合物如醛、醇和其他挥发性化合物来贡献。此外，脂解通过产生直接贡献香气或作为其他挥发性化合物前体的游离脂肪酸，也对此过程做出贡献。这些代谢途径的相对贡献取决于许多因素，包括微生物组成、菌株特异性酶活性、微生物间相互作用以及发酵条件。最终，发酵乳制品中的香气谱是一个代表动态代谢表型的过程，并由多种底物的协调转化所框架化。另一方面，Han等人[27]将酸奶发酵过程中香气化合物的变化与丙酮酸代谢、氨基酸代谢和三羧酸循环等代谢途径关联起来，展示了基于组学的研究在理解这一复杂过程中的重要性和贡献。
除了香气发展，发酵乳制品中质地的改善也依赖于代谢活动。在酸奶和发酵乳的生产中，通常优选德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌等微生物。尽管德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌都能在传统酸奶中合成EPS，但由于嗜热链球菌在发酵早期增殖，它在工业上更常被优选。目标是这两种微生物通过共生关系生产的酸奶每克至少含有10
7 CFU的活培养物。酸奶可能含有位于活细菌细胞质中的活性β-半乳糖苷酶，以及由死细菌释放的活性游离乳糖酶；这些成分有助于乳糖消化。德氏乳杆菌保加利亚亚种，LAB群的重要工业代表，是一种在厌氧条件下利用乳糖作为主要能源提供高产率的菌株。这种微生物以其先进的乳糖分解代谢和高EPS产量在乳制品技术中脱颖而出，还通过其强烈的蛋白水解活性分解酪蛋白，直接丰富最终产品的香气谱和感官质量。
在发酵乳制品中，质地围绕生化、微生物和物理化学过程的网络发展。酸化逐步使酪蛋白胶束不稳定，促进蛋白质凝胶网络形成，而蛋白质水解改变蛋白质基质，影响其结构组织和刚度。此外，根据其分子结构、浓度、位置以及与其他化合物的相互作用，微生物胞外多糖可以改变粘度、保水性、脱水收缩和流变行为。另一方面，发酵乳制品中的质地形成不能仅归因于酸化和EPS生产；起始培养物、蛋白水解活性、发酵动力学和牛奶基质是主要因素。在这里，组学方法在探索微生物代谢活动与质地特性之间的关系方面显示出显著实用性。事实上，酸奶硬度、流动行为和脱水收缩与发酵代谢物之间的关系，以及发酵乳中微生物代谢、流变性质和香气形成之间的联系，已通过组学方法得以阐明。
从功能角度来看，起始培养物还为产品赋予各种生物活性特性。添加某些微生物如副干酪乳杆菌和植物乳杆菌导致通过发酵形成抗氧化肽。在奶酪生产中，起始培养物的选择在蛋白水解活性以及生物活性代谢物和肽的形成方面很重要。在酸奶生产中，添加双歧杆菌对发酵动力学具有多方面影响。这种方法最大化了现有微生物的存活率，加速了酸化过程，显著缩短了目标发酵时间。作为益生菌最常优选的微生物，嗜酸乳杆菌和动物双歧杆菌乳亚种在发酵及后续过程中表现出高pH稳定性。其稳定的生化结构有助于它们在冷藏期间保持活力，并允许它们在最终产品中提供平衡的酸度和感官发育。
发酵乳制品的功能特性也通过蛋白质、脂质、碳水化合物和微生物代谢物的同时转化而塑造。具有潜在抗氧化、抗菌、抗高血压等特性的生物活性肽的形成通过蛋白质水解发生。发酵衍生的代谢物，如微生物EPS，可以贡献于技术功能和生理功能。最终，发酵乳产品的功能潜力不仅由益生菌微生物的存在表征，还由它们生长和与牛奶基质相互作用的结果形成的代谢物和分子表征。与其他特征一样，此处使用组学方法为理解这些代谢过程提供了重要见解。虽然蛋白质组学或肽组学方法在牛奶蛋白和生物活性肽的表征中突出，但代谢组学方法在与功能特性相关的低分子量代谢物的发现中日益突出。例如，一项研究通过代谢组学方法将发酵山羊酸奶中的技术功能特性与发酵衍生的代谢物谱相关联，而其他研究则通过多组学方法证明了发酵乳制品的潜在功能性。实际上，Awwad等人[44]使用LC-MS四极杆飞行时间代谢组学方法与机器学习的组合，预测发酵乳的各种潜在生物活性和功能特性，如抗氧化、抗高血压和抗癌活性。
2.2. 发酵代谢物和基本生化转化
2.2.1. 碳水化合物代谢与有机酸动态
牛奶中的主要碳源乳糖是由α/β-D-葡萄糖和β-D-半乳糖分子结合形成的二糖。牛奶发酵基本基于将乳糖转化为乳酸的机制；作为反应的结果，乳酸作为主要产物释放，而乙酸作为伴随过程的次级代谢物合成。在乳酸发酵期间，牛奶基质中的乳糖并非全部被消耗；仅约初始总乳糖的20%被微生物活动分解和代谢。牛奶发酵涉及三条途径：糖酵解（糖的分解）、蛋白质水解（蛋白质的分解）和脂解（脂肪的分解）。乳糖和蛋白质代谢产生的产物构成酸奶的风味机制。
乳糖通过乳糖通透酶系统或磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统（Lac PEP-PTS）跨细胞膜运输。根据运输机制，进入细胞的乳糖和释放的半乳糖可以通过两种不同的途径代谢。通过通透酶系统进入细胞的未磷酸化乳糖（Lac通透酶）被β-半乳糖苷酶水解为游离葡萄糖和半乳糖，而磷酸化乳糖被磷酸-β-半乳糖苷酶分解为葡萄糖和半乳糖-6-磷酸。游离葡萄糖进入糖酵解的Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径。游离半乳糖转化为葡萄糖-1-磷酸（Leloir途径的终产物），并参与EMP途径；而半乳糖-6-磷酸通过塔格糖途径转化为三糖-3-磷酸（甘油醛-3-磷酸（G3P）和磷酸二羟丙酮（DHAP））。所有这些途径的终产物是乳酸，由乳酸脱氢酶从丙酮酸获得。随着乳酸量的增加，产品的酸度增加，从而pH降低。在低pH水平下，β-半乳糖苷酶失活，阻止乳糖进一步分解并停止发酵。尽管乳糖通过发酵被分解，但它仍可以在发酵乳制品中以4–5%的量存在。乳糖到乳酸的转化途径如图2所示。
在乙醛（赋予酸奶坚果或苹果风味的清新成分）的合成过程中，丙酮酸首先被PDH（丙酮酸脱氢酶）酶脱羧转化为乙酰辅酶A分子。乙酰辅酶A分子被ACDH（乙醛脱氢酶）酶还原为乙醛。丙酮酸不仅从乳糖获得，还通过OAD（草酰乙酸脱羧酶）酶从环境中的柠檬酸经草酰乙酸获得。产生的丙酮酸被α-乙酰乳酸合酶（ALS）和α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDB）酶转化为乙偶姻或双乙酰（主要风味成分）。在反应序列的第一步中，丙酮酸分子主要被ALS酶催化转化为关键的中间代谢物α-乙酰乳酸。此阶段后，代谢途径分支为两个方向。大部分α-乙酰乳酸通过一系列酶促反应被ALDB酶脱羧转化为目标代谢物乙偶姻。剩余部分通过非酶促氧化脱羧（NOD）机制直接转化为双乙酰。
2.2.2. 蛋白质水解与生物活性肽生成
LAB群利用蛋白酶酶将牛奶蛋白分解为肽和寡肽。产生的较小结构通过运输系统（寡肽转运蛋白（Opp）和二肽/三肽转运蛋白（Dpp、DtpP和DtpT））运输到细胞内，并由特定肽酶酶转化为游离氨基酸。这些游离氨基酸转化为各种醇、醛、酸、酯和硫化合物，导致乳制品中特定风味的形成。
2.2.3. 脂解与挥发性香气化合物合成
牛奶脂质通过酶促反应分解的过程称为脂解。在牛奶基质中，该过程可以自发或诱导发生，反应由脂肪酶催化。脂解导致甘油和游离脂肪酸从甘油三酯形成。尽管高浓度的游离脂肪酸会引起苦味缺陷，但在控制水平发生的脂解有助于风味发展，特别是在奶酪等乳制品中。糖酵解、蛋白质水解和脂解产生的中间代谢物在发酵乳制品特征香气谱的形成中发挥基础作用。在酸奶中已检测到超过90种挥发性香气化合物，而在开菲尔中报告了39种，在奶酪中报告了36种。从丙酮酸分支出的香气途径如图3所示。
2.2.4. 功能性微生物代谢物：EPS和细菌素
EPSs在其分子特性（结构、质量、大小、电荷）和流变特性方面表现出广泛多样性，分为两个主要组：HoPS（同多糖）和HePS（异多糖）。HoPSs通常由酸面团衍生的LABs合成，由单一的单糖单元（葡萄糖或果糖）组成。还已知，在商业酸奶生产中使用的某些LABs在牛奶发酵过程中可以合成的EPSs，作为天然生物增稠剂、生物膜形成剂、压力耐受剂和细胞粘附剂在产品内对微生物生态学发挥重要作用。
LABs不仅产生代谢物，还合成抗菌化合物。它们产生的核糖体合成的抗菌肽，能够灭活微生物，被称为细菌素。这些肽具有消除引起微生物腐败的微生物和病原体的能力。由于它们具有蛋白质结构，可以在人类胃肠系统中被蛋白酶酶轻松分解和消化。考虑到这一生理事实，它们在食品工业中被认为对人类食用是完全安全且天然的生物防腐剂。温度、搅拌和pH在细菌素的生产中起重要作用。由细菌素和肽聚糖水解酶（PGH）诱导的LAB细胞中的自溶过程，本质上是一个自我毁灭的过程。该过程通过自溶素和肽聚糖水解酶（作为内源酶的作用）水解细胞壁的主要成分肽聚糖网络，导致细胞结构完全分解。这种裂解过程通过释放的胞内酶以多种方式促进香气发展，并在诸如奶酪成熟等过程中通过促进疏水性苦味肽的分解发挥关键作用。
3. 通过组学技术生成分子数据
虽然传统方法对发酵过程提供了有价值的信息，但不幸的是，它们不足以深入理解微生物群落内复杂的代谢活动和发酵动态。在这里，组学技术的进步为生物水平上生化和分子变化的范围和理解提供了解决方案。
用于深入表征生物分子谱的创新和先进分析方法可以定义为组学技术，而食品领域的这些方法被称为食品组学。食品组学最初由Alejandro Cifuentes于2009年定义为一门学科，是一个在消费者福利、健康和偏好的框架内考虑新鲜或加工食品质量和安全的科学领域。食品组学代表了基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学和脂质组学等组学方法的组合，通过允许详细检查食品的生化、细胞和分子特性并表征这些特性之间的关系，提供了一个富有成果的研究领域。此外，最近出现了术语“营养组学”，用于在分子水平上检查食品、人类健康和饮食之间的关系。这包括诸如营养代谢组学、营养基因组学、营养蛋白质组学、营养转录组学和营养表观遗传学等领域，这些领域专门涵盖体外和体内营养研究。
代谢组学是一种组学方法，用于表征发酵过程中各种微生物代谢物（<1000 Da）。在代谢组学发酵中，起始培养物、底物、微生物群系统、温度和其他参数在监测产品变化中起着关键作用。因此，与传统方法相比，它具有阐明代谢途径、确定代谢物浓度、鉴定代谢物、实现生物标志物选择以及识别影响形成的关键因素等优势。在此，由特定生物体或细胞合成的各种各样的化合物，如氨基酸、寡肽、碳水化合物、核酸、多酚、有机酸、生物碱、维生素和化学化合物，被归类为代谢物。代谢组学方法，包括靶向和非靶向，用于次级代谢物的鉴定、不同代谢化合物的检测以及代谢物多样性的确定。在此，靶向代谢组学应用侧重于确定所需代谢物的量，而非靶向代谢组学方法基于代谢物谱的定义和定量。在代谢组学分析中，从样品中提取内源性代谢物后，遵循以下步骤：色谱分离、半定量和/或定量质谱测定/鉴定，以及应用多变量统计方法表征代谢过程中的变化。在此，食品中的代谢物可以使用超高效液相色谱（UPLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）和核磁共振（NMR）等技术成功检测。Trimigno等人[63]使用1H-NMR代谢组学方法证明，在酸奶发酵过程中，乳糖和蛋白质被分解，同时乙酸盐、乳酸盐和柠檬酸盐的量增加。还强调，乳酸杆菌不产生其生长所需的甲酸盐，而链球菌可以从丙酮酸产生甲酸盐，从而突出了两种菌株之间共生关系的重要性。Rehman等人[35]使用多变量数据分析和回归模型，研究了来自印度本土山羊品种牛奶生产的酸奶中基于GC-MS的代谢物谱。他们报告，通过代谢组学分析，在酸奶样品中鉴定出102种代谢物；使用主成分分析在组之间进行了明确区分，并使用相关热图确定了各种相关性。通过回归分析，研究人员还揭示了各种代谢物与技术功能特性之间的关系。
基因组学应用用于促进发酵过程中微生物的鉴定和表征，以及阐明微生物的遗传功能及其对产品的贡献。基因组学方法中的数据集提供了已详细研究的细菌（例如，许多LAB物种）的完全测序基因组。因此，可以使用这些数据集作为参考，轻松生成所需菌株的原型基因组。因此，仅检查基因组可能足以获得关于微生物所有特征的信息。尽管各种菌株在基因组大小和编码上有所不同，但基因组学分析可以表征代谢过程中涉及的共同基因。此外，这些是编码参与代谢过程（如氨基酸代谢、乳酸生产或香气化合物形成）的酶的基因。另一方面，也可以从头开始使用计算方法估计先前未研究过的微生物的基因组信息，而不依赖于现有的基因数据库。在此，关于DNA序列中特征性基序的信息，如启动子、Shine-Dalgarno序列和转录因子结合位点，允许通过生物信息学转录在先前未鉴定的基因组中识别基因。在基因组学发酵产品中，监测过程不同阶段的微生物动态使得表征产品质量和腐败因素成为可能。得益于先进的技术和数据库，它通过消除传统方法的时间、劳动力和成本等缺点，简化了发酵的控制。Liu等人[68]报告，对从发酵乳制品中分离的227株乳酸乳球菌乳亚种菌株进行的功能基因组学分析揭示，负责碳水化合物利用和乳酸生产的基因的分化事件导致强烈的谱系特异性选择。在全基因组关联结果中，研究人员确定，与pepF和CoiA基因相关的单核酸多态性位点与发酵能力有强关联，从而为潜在的起始培养物创建了快速筛选模型。
“蛋白质组学”由Marc Wilkins于1996年首次使用，是一种提供关于生物系统内蛋白质结构、功能和动力学以及相互作用信息的组学方法。细胞、组织或生物体在特定时期内产生的完整蛋白质集称为蛋白质组。蛋白质组学分为六个分支：功能蛋白质组学、表达蛋白质组学、蛋白质-蛋白质相互作用研究、翻译后修饰分析、结构蛋白质组学和蛋白质组挖掘。Ortea等人[70]根据总体目的将蛋白质组学分为定性、定量和功能蛋白质组学。（1）定性蛋白质组学：指鉴定和表征样品中的所有蛋白质。在此，可以关注样品中的所有蛋白质即蛋白质组，也可以表征蛋白质的子集，如肌浆蛋白、糖基化蛋白和麸质蛋白。（2）差异/定量蛋白质组学：在食品蛋白质组中，蛋白质的相对量可能受食品组成、技术过程以及成分的生物相互作用影响。（3）功能蛋白质组学：本节描述蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间的功能相互作用，以及这些相互作用的结果。近年来，由于液相色谱、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和同位素编码亲和标签（ICAT）等多种蛋白质分离技术的进步，以及质谱和数据库搜索的最新发展，在食品等复杂基质中全面表征蛋白质变得容易。在此，蛋白质表征对于检查组成、识别质量和掺假的指标、表征加工和储存等过程对蛋白质的影响以及鉴定食品过敏原和新型生物活性成分至关重要。在蛋白质组学优化发酵中，应首先考虑具有特定酶活性、表征众多蛋白质并负责塑造发酵产品特征味道、质地和香气的微生物。此外，各种因素如代谢活性、应激、竞争性微生物或化学物质可以改变此处蛋白质的质量和活性。在一项研究中，应用了基于色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）的方法，用于来自不同牛奶和发酵乳制品的致病性肠球菌的蛋白质组学表征。该研究鉴定出代表1327个蛋白质的1403个非重复肽，其中310个包含与肠球菌致病性毒力因子直接相关的蛋白质。研究人员已将数据以标识符PXD036435提交到ProteomeX-change数据库，用于致病性肠球菌物种的研究。Chen等人[73]应用串联质量标签（TMT）标记的蛋白质组学方法，鉴定发酵山羊奶中差异表达的蛋白质，并确定它们与ACE抑制剂活性的关系。观察到ACE抑制剂活性在发酵的0–16小时期间显著增加，而在16–32小时期间趋于稳定。根据蛋白质组学分析，酪蛋白转运在0–16小时期间活跃，而肽酶在16–32小时期间活跃。指出在发酵期间鉴定出525个蛋白质，并且在发酵0小时和发酵16小时之间鉴定的蛋白质存在显著差异。此外，报告在发酵的0–16小时期间检测到58个差异表达蛋白，其中23个上调，35个下调。此外，观察到乳酸菌的胞内肽酶在16–32小时期间形成复杂的蛋白质-蛋白质相互作用网络。Zhang等人[74]研究了发酵乳中植物乳杆菌NMGL2在4°C下21天储存期间对冷和酸胁迫的响应。在鉴定的差异表达蛋白中，发现20个是耐低温蛋白，而10个是耐酸蛋白。此外，报告植物乳杆菌NMGL2通过代谢途径响应胁迫条件，例如丰富的糖脂和糖蛋白的胞外产生、细胞壁成分的生物合成增加、F1Fo-ATP酶表达增加、细胞修复相关蛋白和分子伴侣转化为适当蛋白增加，以及谷氨酸脱酸系统的激活。
简而言之，用于理解不同条件下各种基因类型表达的组学方法定义为转录组学。转录组定义为生物体中基因组产生的所有RNA转录物的完整集合，它编码DNA中的信息并与表型联系。转录组主要包括编码mRNA，但也包括核糖体rRNA、转移tRNA和sRNA。mRNA非常重要，因为它们在表征细胞的分子成分和功能因素方面有效。转录组通过以下阶段进行表征：识别所有转录物、阐明基因的转录结构，以及最终量化不同条件下转录物的不同表达水平。在转录组学方法中，使用诸如实时逆转录（RT）-PCR、微阵列、表达序列标签技术（EST）、下一代RNA测序（RNA-seq）、大规模平行签名测序（MPSS）和基因表达序列分析（SAGE）等技术，其中RNA测序和微阵列经常被优选。在微阵列方法中，根据与互补核苷酸探针通过杂交结合的水平，测量预定转录物簇的丰度。在RNA测序技术中，所有转录RNA被转化为cDNA，然后使用高通量测序方法鉴定。Sun等人[80]从发酵乳制品中分离的79株乳酸菌中，基于其强大的生物膜形成能力，研究了植物乳杆菌J26的生物膜特征，并基于使用实时RT-PCR的转录组测序检查了代谢途径。在转录组测序中，差异表达基因（DEGs）被报告参与诸如嘧啶代谢、甘油代谢和胁迫响应等途径，这些分析来自基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）。使用唾液链球菌嗜热亚种Snew生产的牛奶在发酵阶段进行的转录组学分析表明，DEGs在蛋白质、碳水化合物、氨基酸、脂肪和脂肪酸等不同类别中被筛选，并且它们因发酵阶段而异。Tian等人[82]在分别和联合使用菌株生产的酸奶（使用嗜热链球菌SIT-20.S和德氏乳杆菌保加利亚亚种SIT-17.B菌株）的转录组学分析中，在风味化合物途径中检测到DEGs。此外，报告使用嗜热链球菌SIT-20.S由于编码乙偶姻还原酶的基因（SIT-20S_orf01454）减少而增加了乙偶姻积累。在嗜热链球菌SIT-20.S菌株中，编码乙醛脱氢酶的基因（SIT-20S_orf00949）上调，并报告在两种菌株中醇脱氢酶表达下调，从而维持乙醛水平。另一方面，强调在德氏乳杆菌保加利亚亚种SIT-17.B菌株中，编码ADH氧化酶的基因（SIT-17B_orf00860）上调，增加了乙偶姻和双乙酰的积累。
脂质组学是一种研究生物系统中脂质变化并表征脂质谱的组学方法。食品中的脂质类型和结构（饱和度、链长等），如脂肪酸、磷脂和鞘磷脂，可以使用各种色谱技术如基质辅助激光解吸电离（MALDI）MS、GC-MS和LC-MS轻松鉴定。脂质组学应用的进展允许高效、准确和精确地详细描述脂质在代谢过程中的作用。乳制品的脂质组学表征在质量控制、成分分析和来源识别等应用中起着重要作用。应用于各种发酵乳制品的组学方法和数据分析见表1。
然而，单一组学应用仅关注识别特定生物过程，不足以表征发酵过程中发生的微生物活动背后或成分之间相互作用的复杂机制。因此，单一组学应用仅提供蛋白质、代谢物或核酸等成分水平的单一结果，甚至不足以充分代表不同转录条件下的代谢组和蛋白质组。总之，上述单一组学技术各自提供了重要且有价值的信息。另一方面，对于像发酵这样的交互式复杂过程，除了更高效和精确地识别关键因素外，还需要整合多组学方法，以便以关联的方式表征生化和微生物机制。因此，在这个复杂系统中，多组学应用已成为以深入和整体方法表征目标分子及其所有相互作用不可或缺的一部分。对于多种应用，例如，整合转录组学和代谢组学实践可以通过识别参与特定代谢物产生的调控基因和代谢途径，帮助发现代谢物-基因关系。代谢组学和蛋白质组学的整合，使得能够鉴定影响代谢物多样性的酶辅助反应，并提供对代谢组学单独作用不足的翻译后修饰的见解，可以作为多组学方法的另一个例子。Yuan等人[96]使用多组学方法，包括宏基因组学（深度测序）、代谢组学（非靶向代谢组学）和蛋白质组学（抗体芯片蛋白检测）层，以阐明在高血压大鼠中用植物乳杆菌SR37-3发酵的牛奶的抗高血压活性机制。研究得出结论，向大鼠喂食发酵乳显著降低了它们的血压，并且该结果与肾素-血管紧张素系统的部分失活有关。发酵乳已被报告通过其在肠道微生物群中诱导的重塑来调节关键宿主代谢途径，并且这种微生物群重塑与抗高血压活性相关。Cheng等人[97]通过整合代谢组学和转录组学分析，研究了用德氏乳杆菌保加利亚亚种BG菌株生产的发酵乳中的物理化学动态和代谢过程。多组学整合揭示，主要能量途径是糖酵解，并且发酵通过限制TCA循环，通过乳酸脱氢酶（LDH和ldhA）将丙酮酸重新导向乳酸。报告上调的肽酶基因有助于形成引起苦味的疏水性二肽，而增强的中链脂肪酸合成基因有助于形成香气化合物如辛酸和正癸酸。
表2提供了一个总结，比较了组学技术的优势、局限性和缺点，强调了它们在优势和劣势方面的适用性。因此，这些信息也将有助于批判性评估组学技术在牛奶发酵中的互补作用。
多组学方法通过填补不可靠或不完整的信息，有助于提高小规模数据的准确性和精确度。因此，诸如交叉验证分析或靶向相关性等技术允许准确表征许多生物标志物，包括关键基因、优势菌株、重要蛋白质、酶或特征香气成分。发酵产品的质量主要取决于其微生物种群内的功能相互作用。另一方面，传统发酵通过自发发展的微生物过程进行，这突显了其对原料组成、操作实践变量和环境因素等参数的敏感性。因此，生产过程中自然发生的变异性给实现标准化和高质量产品带来了挑战。在此背景下，近年来使用多组学技术表征发酵产品获得了显著动力。得益于这一技术进步，可以在发酵过程中更详细地检查微生物组成、DEGs、代谢途径和蛋白质表达水平。尽管发酵食品根据微生物、底物、环境和加工条件表现出代谢差异，但蛋白质、氨基酸及其衍生物、碳水化合物、脂肪酸、多酚、有机酸、核苷酸、维生素和类黄酮化合物基本上构成了发酵代谢物。通过整合各种组学应用来表征发酵过程，可以创建全面数据库，为进一步研究和应用提供重要支持。得益于创建的数据库，可以系统整理多维数据，并轻松发现关于发酵成分或微生物的基本信息。例如，整合了超过2500个食品来源的宏基因组数据集的curatedFoodMetagenomicData（cFMD）；包含131个细菌、28个真核生物和38个古菌基因组序列的与发酵食品相关的微生物组学数据资源（ODFM），这是一个专门数据库；以及包含6358个序列条目和4710个使用EasyAmplicon分类的微生物分类的FoodMicroDB数据库，在该领域脱颖而出。此外，为了检查优化发酵过程的目的，FermFoodDb数据库提供2205个条目，涵盖肽序列、食品来源、质量和IC50、功能活性、起始培养物、发酵条件、序列的体外或体内测试条件、分析方法和模型类型等关键领域。此外，还有发酵乳制品数据库（FDF-DB），这是一个包含
