系统水平洞察流感B病毒感染中年龄依赖性先天免疫反应

《Microbiology Spectrum》：Systems-level insights into age-dependent innate immune responses in influenza B infection

　　

已知衰老会改变先天免疫功能，增加对病毒感染的易感性，但其对流感B病毒（IBV）感染的具体影响仍缺乏充分表征。为填补这一空白，研究人员使用临床相关IBV株Inf B/Phuket/3073/2013开发了一个临床前小鼠模型，比较年轻成年和年老小鼠的先天免疫反应，特别关注感染期间肺部的年龄相关转录组和蛋白质组改变。对感染后收获的肺组织进行批量RNA测序和蛋白质组学分析，揭示了不同的年龄依赖性转录谱。批量RNA-seq分析鉴定出1,350个差异表达基因（DEG），其中824个表现出年老偏向的表达模式，并在感染流感B病毒的老年小鼠肺中显著上调。这些DEG的功能富集表明，年老小鼠的先天免疫信号传导、凋亡以及与细胞应激和DNA损伤相关的通路受到干扰。在年轻成年和年老小鼠的流感B感染中，鉴定出多个差异表达蛋白，其中一些共同表达的蛋白在病毒进入、信号通路和干扰素反应中发挥作用。实时PCR分析证实了关键先天免疫基因的表达改变，包括Toll样受体（TLR）、干扰素调节因子（IRF7和IRF9）、关键抗病毒基因（IFIT-2、IFIT-3和STAT-1）以及I型和II型干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）。值得注意的是，年轻成年小鼠表现出更协调和强烈的抗病毒通路激活，而年老小鼠则表现出延迟和异常的免疫反应，以过度炎症和干扰素信号受损为特征。重要性：本研究提供了流感B病毒（IBV）感染期间年龄驱动先天免疫改变的系统水平综合分析。虽然先前证据已确立衰老会损害多种病毒感染的抗病毒反应，但本研究结果具体表明，年老小鼠的IBV感染导致先天免疫通路的过度和失调转录激活，包括过度的I型干扰素信号传导和改变的炎症介质谱，并揭示了改善老年人群流感感染健康结局的潜在治疗靶点。

**论文解读：系统水平洞察流感B病毒感染中年龄依赖性先天免疫反应**

**研究背景、问题及开展原因**
流感是全球流行的病毒感染，65岁以上人群住院率和死亡率显著高于年轻成年人。流感B病毒（IBV）是季节性流感的主要类型之一，对儿童、老年人和免疫功能低下者构成严重威胁。衰老伴随免疫功能的进行性衰退（免疫衰老），影响先天和适应性免疫。尽管已有研究关注流感A病毒（IAV）的年龄依赖性免疫反应，但IBV感染中年龄对宿主先天免疫的影响尚不明确。现有研究多集中于小鼠适应株的致病性，缺乏对临床相关IBV株（如B/Phuket/3073/2013，Yamagata谱系）在年老宿主中的免疫反应系统分析。因此，研究人员开发了临床前小鼠模型，结合转录组学和蛋白质组学，系统探究年龄如何改变IBV感染后的先天免疫反应，为老年人群的疫苗和治疗策略提供依据。该论文发表在《Microbiology Spectrum》。

**主要技术方法**
研究人员使用临床相关IBV株Inf B/Phuket/3073/2013（Yamagata谱系），在雌性BALB/c小鼠（年轻成年组6-8周龄，年老组>18月龄）中建立致死性感染模型。通过测定半数致死剂量（MLD₅₀）和病毒滴度（TCID₅₀）评估易感性。采用批量RNA测序（bulk RNA-seq）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析感染后第5天（dpc）的肺组织。使用定量实时PCR（qRT-PCR）验证关键基因表达，并通过Western blot验证蛋白质水平。数据使用edgeR、clusterProfiler、Metaboanalyst等工具进行差异表达和通路富集分析。

**研究结果**

**Age-dependent host response model for influenza B virus**
通过建立致死性感染模型，发现年老小鼠在感染后5-7天内全部死亡，而年轻成年小鼠在7-9天内死亡，表明年老小鼠对IBV更易感，疾病进展更快。

**Elevated viral load and titer in the lungs and BALF of aged mice following influenza B infection compared to young adults**
年老小鼠的肺和支气管肺泡灌洗液（BALF）中病毒滴度和病毒载量显著高于年轻成年小鼠，且病毒在年老小鼠的肾、脾、肝、脑等肺外器官中也有检出，提示病毒清除受损和屏障功能下降。

**Influenza B virus infection drives distinct transcriptomic signatures in young adult and aged mouse lungs**
批量RNA-seq分析显示，年轻成年小鼠仅12个差异表达基因（DEG），而年老小鼠有2,523个DEG。去除年龄基线差异后，鉴定出1,350个DEG，其中824个在年老小鼠中上调（年老偏向），526个下调（成年偏向）。年老小鼠表现出过度炎症和免疫失调特征。

**Transcription factors and RNA-binding proteins as mechanistic drivers**
通过基因集富集分析（GSEA）发现，转录因子（TF）靶点富集于EGFR和MAPK3信号通路，RNA结合蛋白（RBP）通路显示rRNA加工、RNA剪接等后转录调控机制严重失调，提示炎症反应受RNA加工和稳定性调控。

**RNA sequencing global kinetics and age-induced changes in young adult and aged mouse lungs**
基因本体（GO）、KEGG和Reactome过度表达分析（ORA）显示，年老小鼠中上调基因富集于“细胞因子产生正调控”、“病毒应答”、“I型/II型干扰素应答”、“TNF信号通路”、“IL-17信号通路”等，而下调基因富集于“肌原纤维组装”、“肌肉收缩”、“血管平滑肌收缩”、“钙信号”等，提示组织稳态和血管功能严重受损。

**Identification of differentially expressed proteins in IBV infection among young adult and aged mice**
蛋白质组学分析鉴定出761个差异表达蛋白（DEP），其中84个在年老小鼠中上调，4个下调。常见共表达蛋白涉及病毒进入、信号通路和干扰素反应。Venn图显示不同比较组间有大量重叠蛋白。

**Functional enrichment of differentially expressed proteins in the lungs of young adult and aged mice upon influenza B infection**
Reactome通路分析显示，年老小鼠中上调的DEP富集于“MHC II类抗原呈递”、“Toll样受体级联反应”、“补体系统”，而下调的DEP富集于“MAPK家族信号级联反应”、“B细胞受体下游信号”。此外，p53非依赖性DNA损伤反应上调，导致慢性炎症和免疫稳态失调。

**Influenza B virus induces distinct innate immune profiles in young adult vs aged BALB/c mice**
实时PCR检测Toll样受体（TLR1-9）和干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）表达。年轻成年小鼠中TLR1、TLR2、TLR6、TLR5、TLR4等上调，而年老小鼠中这些TLR下调或表达模式相反。TLR3、TLR7、TLR9在年老小鼠中上调，年轻成年小鼠中下调。I型和II型干扰素在年轻成年小鼠中上调，年老小鼠中下调，表明年老小鼠先天免疫信号延迟和失调。

**Validation of the key genes identified in bulk RNA-seq data among young adult and aged mice in influenza B infection**
通过qRT-PCR验证了8个关键基因（IFIT2、IRF7、IRF9、STAT1、ISG15、Cdkn1a、IL1rn、IFIT3），结果与RNA-seq一致。Western blot验证了IFN-β和ISG15蛋白在年老小鼠中表达升高，进一步证实年龄依赖性干扰素反应的改变。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究成功建立了临床相关IBV株的致死性小鼠模型，重现了老年人群中的严重疾病特征。年老小鼠对IBV高度易感，病毒清除能力差，且出现系统性病毒播散。转录组和蛋白质组分析揭示年老小鼠的免疫反应以过度炎症（如TNF、IL-17、NOD样受体通路）和组织稳态丧失（如肌纤维、血管功能抑制）为特征，与免疫衰老一致。关键基因如Cdkn1a、CSF3、IFIB1等上调，与衰老相关。转录因子和RNA结合蛋白分析显示EGFR/MAPK通路和RNA加工机制参与失调反应。蛋白质组学鉴定出IFI35、IRGM1、DDX3X等与干扰素信号和病毒感知相关的蛋白。TLR和干扰素表达分析表明年老小鼠早期先天免疫反应迟钝，可能导致后期炎症风暴。研究局限性包括单时间点分析，未来需纵向多组学验证。结论：这些发现提供了年龄依赖性宿主反应如何影响IBV感染结局的重要见解，整合病毒学、病理学、转录组学和蛋白质组学证据，表明衰老与增强的疾病严重性相关，并揭示了潜在治疗靶点和生物标志物，为未来开发年龄特异性疫苗和疗法提供了基础。尽管B/Yamagata谱系近期流行下降，但本研究的模型和多组学方法可推广至其他流感病毒亚型。