使用荧光指纹成像可视化柿子中的多酚分布

《Journal of Food Measurement and Characterization》：Visualization of polyphenol distribution in persimmons using fluorescence fingerprint imaging

　　

摘要
多酚是重要的功能性化合物，然而其空间分布在不进行破坏性提取的情况下仍难以定量。本研究旨在利用荧光指纹（FF）成像技术可视化柿子横截面中的多酚分布，该技术可在激发波长与发射波长的多种组合条件下测量荧光强度。首先，基于偏最小二乘回归模型的载荷，确定了用于可视化多酚的关键波长，该模型用于从FF数据估算可提取多酚含量（EPP）。研究选取了激发波长260–350 nm和发射波长330–440 nm的波长范围，并在这些波长条件下获取了五个柿子品种在未成熟期和成熟期的荧光图像。主成分（PC）分析的载荷与表儿茶素的FF特征相匹配，其得分集中在种子和果芯附近。然而，PC1得分与实际EPP含量呈负相关（r = ?0.29），在果皮和未成熟果实中得分较低，而EPP含量在这些部位反而较高。为理解这一差异，研究人员将咖啡酸、槲皮素和表儿茶素的标准溶液以不同浓度混合，并测量了其FF和吸收光谱。结果表明，表儿茶素的荧光被其他共存的多酚（如咖啡酸和槲皮素）重新吸收。因此，混合物的荧光强度反映的是不同荧光化合物与吸收化合物之间的相互作用，而非总多酚的浓度。虽然FF成像捕捉到了荧光组分的空间异质性，但研究结果强调了由于分子间相互作用，在完整组织中解读自发荧光信号存在复杂性。

论文解读：基于荧光指纹成像的柿子多酚空间分布可视化研究

一、研究背景与问题提出

多酚是一类分子结构中含有多个羟基连接至苯环的化合物，因其在疾病预防和健康促进方面的功能活性而受到广泛关注。水果和蔬菜富含多酚类物质，其中柿子（Diospyros kaki）近年来因其特别丰富的多酚含量而成为研究热点。传统的多酚分析方法主要包括比色定量法和高效液相色谱法（HPLC）等化学分析手段。尽管这些方法具有较高的准确度，但通常需要对样品进行分离和提取处理，因此只能测量提取样品的平均含量，无论采样对象为完整果实还是局部组织，均难以了解各化合物在果实内部的空间分布特征。然而在许多情况下，功能性化合物如多酚主要存在于不可食部分，如水果果皮中，因此实际摄入的多酚量可能与全果定量结果存在差异，阐明其分布特征具有重要意义。

已有的化合物分布可视化方法包括近红外光谱成像和质谱成像等技术。质谱成像需要对样品进行冷冻和薄切片处理，难以应用于含水量较高的农产品如蔬菜和水果；近红外光谱成像则基于近红外区域分子振动和转动能级产生的吸收光谱构建图像，但由于水在红外区域存在宽泛吸收，该技术同样不适用于高含水量农产品。为应对上述挑战，研究者将目光转向了荧光指纹（FF）技术，也称为激发-发射矩阵（EEM）。与通常在单一激发波长条件下进行的常规荧光测量不同，FF可同时改变激发和发射波长条件并全面测量荧光强度，从而获得由激发波长、发射波长和荧光强度组成的三维数据。该方法能够收集目标组分的大量信息，包括荧光强度较弱的波长条件，因此适用于像食品这样包含多种混合组分的样品。此外，水在近红外光谱中存在的问题不会显著影响FF测量，因为水不发射荧光。近年来，FF测量已被广泛应用于食品产地识别和成熟度量化等领域。

FF成像是一种多光谱成像技术，可为图像中每个像素获取FF数据。与主要利用吸收和反射光谱的近红外光谱成像不同，FF成像不仅改变检测到的荧光波长，还改变照射到样品上的激发波长，即为每种激发和发射波长组合获取图像。由于FF对每种化合物呈现特征性模式，FF成像能够从图像数据中可视化多种化合物的分布。该技术测量目标组分自身发射的自发荧光，因此无需冷冻或切片等预处理。具有芳香环的化合物如多酚通常表现出自发荧光特性，主要在紫外至可见光区域发光。基于上述特性，本研究旨在利用FF成像技术实现柿子中多酚分布的可视化。柿子的涩味由多酚引起，已知甜柿和涩柿在多酚含量和状态上存在差异。由于FF成像需要对每种激发和发射波长组合获取图像，测量时间随波长数量增加而延长，因此需要针对多酚可视化的目标定制所使用的波长范围。

二、研究开展内容与主要结论

研究人员首先构建了偏最小二乘（PLS）回归模型，利用柿子提取物的FF数据估算多酚含量，并基于模型载荷筛选出对多酚含量贡献最大的波长范围，即激发波长260–350 nm和发射波长330–440 nm。随后在该波长条件下获取了五个柿子品种未成熟期和成熟期果实的横截面荧光图像，并对每个像素的FF进行主成分分析（PCA）以可视化多酚分布。最后，通过测量混合标准溶液的荧光和吸收光谱，研究了柿子中自发荧光物质之间的相互作用及其与荧光强度的关系。该研究成果发表于《Journal of Food Measurement and Characterization》。研究发现，PC1载荷与表儿茶素的FF特征吻合，得分集中在种子和果芯附近，但PC1得分与实际可提取多酚含量（EPP）呈负相关（r = ?0.29）。通过标准溶液混合实验证实，表儿茶素的荧光可被咖啡酸和槲皮素等其他共存多酚重新吸收，表明混合物荧光强度反映的是不同荧光化合物与吸收化合物之间的相互作用，而非总多酚浓度。该研究揭示了FF成像在捕获荧光组分空间异质性方面的潜力，同时强调了完整组织中分子间相互作用导致自发荧光解读的复杂性。

三、主要关键技术方法

本研究涉及的核心技术方法包括以下几个层面。在样本来源方面，用于波长选择的柿子样品于2024年收获自筑波大学T-PIRC农场，包括松本早生（ pollination-constant and non-astringent ）和平核无（pollination-variant and astringent）两个品种；用于成像的样品于2025年收获自同一农场，包括松本早生、早秋（Sōshū）、西村早生（Nishimura-wase）、禅寺丸（Zenjimaru）和平核无五个品种。主要技术方法包括：（1）荧光指纹（FF）成像系统，由氙灯光源、两类型带通滤光片和12位数字单色CMOS相机组成，可在多种激发和发射波长组合下采集荧光图像；（2）偏最小二乘（PLS）回归建模，用于从FF数据估算EPP含量并基于载荷选择关键成像波长；（3）主成分分析（PCA），对十个样品（5个品种×2个采样期）感兴趣区域（ROI）内所有像素的FF数据进行降维分析以提取主要成分分布模式；（4）标准溶液混合实验，测量表儿茶素、咖啡酸和槲皮素及其混合溶液的FF和吸收光谱，以解析多酚间荧光相互作用机制。

四、研究结果

（一）柿子乙醇提取物和标准溶液的荧光指纹特征
涩柿品种平核无果肉的EPP含量为736.1 ± 34.8 mg/100 g，果皮为175.3 ± 17.3 mg/100 g；甜柿品种松本早生果肉为58.4 ± 16.0 mg/100 g，果皮为372.3 ± 57.2 mg/100 g。涩柿果肉中EPP含量极高，表明可溶性多酚主要分布于果肉而非果皮；相反，甜柿中大部分可溶性多酚存在于果皮。除平核无果肉提取物外，在激发波长280 nm和发射波长300–320 nm处观察到与表儿茶素荧光峰一致的荧光峰。平核无果肉提取物在激发波长230–260 nm范围内荧光强度极低，提示高多酚浓度下发生了浓度猝灭。果皮提取物中观察到叶绿素A荧光以及可能来自酚类、木质素和香豆素等化合物的荧光组分。槲皮素在水溶液中几乎不显示荧光，因其与水分子形成强氢键抑制了荧光发射。

（二）基于PLS回归模型的波长选择
PLS回归模型的交叉验证结果显示，潜变量数设为2时，校正和交叉验证的决定系数（R²）分别为0.87和0.80，表明模型成功捕捉了EPP含量的变化趋势。第一潜变量解释了自变量约48%的方差和目标变量约70%的方差。第一潜变量载荷绝对值较大的波长区域与Fig. 2中柿子提取物的荧光峰位置一致，但载荷系数为负值，表明这些波长带处较低的荧光强度对应较高的多酚含量估算值。最终选定激发波长260–350 nm和发射波长330–440 nm作为成像波长范围。

（三）成分分布的可视化
荧光图像整体显示两个高强度波长区域：激发260–300 nm/发射330–370 nm和激发320–350 nm/发射400–440 nm。较短波长范围内，种子和内果皮区域观察到显著荧光；较长波长范围则在果肉中呈现均匀荧光。所有波长条件下果皮均未观察到明显荧光。PC1在激发260–300 nm/发射330–370 nm的短波长区域具有较大载荷值，与表儿茶素荧光峰一致，PC1得分围绕种子和果实中心分布，成熟果实通常比未成熟果实具有更高的PC1得分。PC2在激发320–340 nm/发射420–440 nm的较长波长区间载荷较高，对应木质素和酚类化合物的荧光波长。不同授粉类型品种的PC2得分分布存在差异。尽管PC1载荷与表儿茶素FF匹配，但PC1得分强度与EPP含量不相关，果肉多酚含量与平均PC1得分之间的相关系数为?0.29，表明与儿茶素FF相关的PC与EPP含量呈负趋势。

（四）不同多酚之间的相互作用
为理解儿茶素荧光与实际EPP含量之间的矛盾相关性，研究人员向表儿茶素溶液中依次添加咖啡酸和槲皮素制备混合溶液。添加咖啡酸后，除表儿茶素荧光外观察到咖啡酸荧光，但整体荧光强度下降，且下降幅度在咖啡酸吸光度较高的区域更为明显，表明表儿茶素荧光被咖啡酸吸收。进一步添加槲皮素后，在槲皮素吸收较强的激发260 nm处荧光强度下降尤为显著；在短于250 nm的激发波长下，吸收普遍较强，表儿茶素在激发230 nm/发射320 nm处的荧光几乎被完全吸收。这些结果表明，激发230 nm/发射320 nm处峰的强度不仅受表儿茶素含量影响，还会因咖啡酸和槲皮素等其他物质的荧光再吸收而受到负面影响。

五、讨论与结论

研究讨论部分指出，本研究存在若干局限性。用于波长选择的柿子样品在数量和变异性上有限，不同季节、品种和成熟阶段的多酚含量及基质组成可能存在较大差异，从一组样品中选取的波长未必适用于其他样品。此外，Folin-Ciocalteu法会与抗坏血酸等还原剂发生反应，柿子中抗坏血酸含量为30–200 mg/100 g，在非涩柿品种中含量更高，可能对低EPP含量样品的测量产生较大影响。乙醇标准溶液测量与完整果肉组织测量之间也存在差异，完整组织中激发光会被组织微结构强烈散射，散射特性可能受果实硬度和可溶性固形物含量变化影响，不同品种和成熟度也可能影响光散射。冷冻处理形成的冰晶可能破坏细胞结构并导致可溶性化合物在细胞间重新分布。研究还指出，使用与拉曼信号相关的归一化方法将有利于光谱仪与FF成像系统之间数据的更好对齐。

研究结论部分指出，本研究证明了利用荧光指纹（FF）成像可视化柿子多酚分布的潜力及其固有挑战。研究发现涩柿和非涩柿品种之间、果皮和果肉组织之间的荧光化合物分布存在显著差异。然而，作为多酚主要单元之一的表儿茶素的荧光强度与实际化学定量结果呈负相关关系。通过测量表儿茶素、咖啡酸、槲皮素及其混合物的FF和吸收光谱，实验表明表儿茶素荧光很可能被咖啡酸和槲皮素等其他多酚重新吸收。总之，虽然FF成像提供了果实内部化学环境的高分辨率图谱，但特定多酚浓度的直接可视化需要对内部吸收效应进行仔细校正。未来研究应聚焦于开发这些内滤效应（特别是由于荧光再吸收导致的次级内滤效应）的数学校正模型，以实现从定性可视化向农产品中功能性化合物精确、非破坏性定量图谱的转变。