关于大肠杆菌对反复暴露于纳米级零价铁的适应性反应的机制学见解

《Environmental Pollution》：Mechanistic insights into the adaptive responses of Escherichia coli to repeated nanoscale zero-valent iron exposure

　　

摘要

随着纳米零价铁（nZVI）在地下水修复中的广泛应用，微生物在水生环境中的暴露频率和持续时间正在稳步增加。尽管关于nZVI诱导的毒性的研究已经很多，但在重复或长期暴露于nZVI下，微生物的生存策略和适应性抵抗机制仍然很大程度上未被阐明，特别是在厌氧地下环境中。本研究以大肠杆菌作为典型的革兰氏阴性兼性厌氧菌模型，系统地探讨了其在有氧和厌氧条件下的响应。经过20次连续的nZVI暴露-培养循环后，细菌菌株在厌氧条件下的抵抗力比在有氧条件下更强。从机制上看，耐药菌株表现出更高的生物膜生物量和厚度（是原始菌株的1.55-2.00倍，p < 0.001），细胞内的Fe²⁺积累减少，过氧化氢酶活性提高，以及膜电位和脂质稳态的更好维持。转录组分析显示，nZVI抑制了核糖体和能量代谢功能，同时激活了应激响应途径（例如，双组分系统、运输、全局代谢调节），从而通过多模式协同机制介导了抗性。值得注意的是，耐nZVI的菌株对Ag和Cu纳米颗粒也表现出交叉抗性，并且在传代后具有稳定的表型继承性，在接合实验中具有潜在的种内传递能力。这项研究揭示了在模型系统中重复nZVI暴露下微生物的抵抗机制，为评估nZVI的生态安全性及其环境应用提供了机制基础。

引言

纳米零价铁（nZVI）及其改性衍生物，如硫化nZVI、碳载nZVI和界面工程nZVI，由于其高反应性和强还原性，在地下水修复中得到了广泛应用（Huang等，2026；Mohana Rangan等，2023；Wang等，2025a；Zhao等，2016）。因此，它们的环境命运和生态效应受到了越来越多的关注（Mondal等，2021）。作为水生生态系统的基本组成部分，微生物越来越频繁且长时间地接触到基于nZVI的材料，因为这些材料的释放量在不断增加（Dong等，2019；Liang等，2025）。尽管目前的研究主要集中在nZVI诱导的微生物毒性上（Li等，2022；Sun等，2019），但这种单一维度的视角未能全面评估nZVI的环境暴露风险和生态安全影响。更重要的是，在长期nZVI暴露下，微生物可能会发展出对纳米颗粒的耐受性或相关抗性，类似于抗生素抗性的获得（Zhang等，2020a）。因此，需要系统地和多维度地研究微生物对nZVI的潜在应激防御机制和适应性反应。

值得注意的是，这种微生物适应性和随后的nZVI抗性可能是由实际环境修复场景中的重复或慢性nZVI暴露所驱动的选择压力引起的（Kotchaplai等，2017）。在工程应用中，通常采用nZVI的反复注入和其在地下水中的循环利用，以及在厌氧消化和anammox生物反应器中的间歇性补充，以优化污染物去除和生物反应器的性能（支持信息表S1）（Ahn等，2021；Cen等，2025；Nunez Garcia等，2020）。这些重复的剂量方法通过累积效应对本土微生物施加动态的选择压力，可能触发微生物的应激防御机制并推动抗性的发展（Zhang等，2020a）。此外，未完全反应的nZVI残留物在原位修复污染地点后倾向于聚集和沉积在环境基质中（Ahn等，2021）。特别是，nZVI颗粒表面的钝化延迟增强了其在厌氧地下水修复过程中的物理化学稳定性（Liu等，2017）。nZVI通常以g/L的浓度注入，修复后其残留水平保持在mg/L级别（Mueller等，2012）。一个例子是，在注入5-12 g/L nZVI悬浮液103天后，从地下水中检测到了由残留的Fe⁰和亚铁（水）氧化物组成的nZVI固相铁，浓度为3.86 mg/L（Ahn等，2016）。总的来说，这些发现表明，重复的nZVI剂量策略和持久存在的环境nZVI残留物共同延长了微生物对nZVI的暴露时间。这种长期暴露会持续抑制微生物活性，可能导致持久的和累积的生态影响。

在重复或慢性nZVI暴露下，微生物表现出复杂且双相的细胞响应。具体来说，有研究表明，在10次重复的有氧nZVI暴露后，假单胞菌（P. putida）F1的细胞膜硬度通过膜脂肪酸的重组得到了增强（Kotchaplai等，2017）。这种膜结构重塑减轻了nZVI引起的膜液化效应，从而增强了细菌对nZVI的适应性（Zhang和Zhang，2020）。此外，低剂量的nZVI促进了微生物分泌胞外聚合物物质（EPS），进一步促进了生物膜的形成并稳定了微生物群落（Gao等，2025）。与上述适应模式相反，其他研究则表明，在有氧nZVI暴露下的连续传代培养也可能抑制外排转运蛋白的表达并导致细胞膜损伤，从而降低细菌的抗生素抗性（Wang等，2024a；Yu等，2022）。鉴于这些相互矛盾的发现，微生物对重复和慢性nZVI暴露的响应仍需要系统的研究。此外，与有氧条件不同，nZVI在厌氧环境中保持其颗粒结构完整性（Liu等，2017）。这种物理化学稳定性延长了nZVI的寿命，可能通过持续释放生物活性成分（如Fe²⁺）加剧了生物积累的风险（Phenrat和Lowry，2019）。然而，微生物在厌氧条件下反复暴露于nZVI时的应激反应网络和适应性抵抗机制尚未得到探索。此外，nZVI抗性相关表型的稳定性和潜在的可传递性仍不明确。

在这项研究中，选择了原始的nZVI作为基本材料，以避免表面改性的干扰，并探索微生物的内在适应反应。大肠杆菌（E. coli）作为典型的革兰氏阴性兼性厌氧菌，被选为模型微生物，在有氧和厌氧条件下对其在20次重复暴露期间的应激反应轨迹进行动态追踪。我们系统地评估了铁的溶解动力学、抗氧化酶活性、细胞膜结构和功能以及生物膜形成能力。同时，通过转录组测序来解析E. coli在nZVI诱导应激下的关键生物功能和能量代谢途径。此外，本研究还检测了耐nZVI菌株对其他纳米抗菌剂（纳米银（nAg）和纳米铜（nCu）的交叉抗性，以及所开发的抗性向其他微生物的垂直传播和种内水平传递的可能性。所识别的微生物抗nZVI机制为优化nZVI在特定地点的地下水修复应用提供了重要见解。

部分片段

试剂、nZVI合成和细菌培养

有关试剂、nZVI合成、细菌培养和nZVI表征的详细信息见文本S1-S3和图S1。

重复暴露实验

为了探索大肠杆菌对nZVI的适应性抵抗机制，我们将重复暴露浓度设定为10 mg/L。虽然这个浓度可能不反映所有地下水修复场所的平均残留nZVI水平，但它对应于注射区或颗粒沉积热点附近的局部升高浓度。

在20次连续的nZVI暴露过程中，细菌抗性的适应轨迹如图1a所示。在有氧条件下，nZVI对大肠杆菌的毒性在最初的14次暴露周期内没有显著变化（p > 0.05）。然而，在第15次暴露后，毒性明显减弱，到第20次暴露时，其灭活效率降低了1.64 ± 0.85 log（p = 0.0064）。相比之下，

结论

我们的结果表明，在测试条件下，重复nZVI暴露与大肠杆菌抗性表型的发展有关。耐药E_nZVI菌株表现出更高的生物膜生物量和厚度，细胞内的Fe²⁺积累减少，过氧化氢酶活性持续，以及膜结构和功能的保持。这些变化与对nZVI的增强抗性相关，并与生物膜调节和抗氧化作用的保护作用一致。

董浩然：写作——审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。董志奇：写作——审稿与编辑。赖本福：写作——审稿与编辑。王敖：写作——审稿与编辑。黄道芬：写作——审稿与编辑，方法学。肖双杰：写作——审稿与编辑，形式分析。张浩轩：写作——审稿与编辑，可视化，软件。李龙：撰写——初稿，方法学，调查，数据管理

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了湖南省科技创新计划（2025RC1025）、湖南省自然科学基金（2025JJ30020）和国家自然科学基金（52122011）的支持。

李龙|张浩轩|肖双杰|黄道芬|王敖|赖本福|董志奇|董浩然

湖南大学环境科学与工程学院，长沙，湖南410082，中国