通过加压热液萃取获得的 Origanum acutidens (Hand.-Mazz.) Ietsw. 提取物的酚类含量、抗氧化潜力及酶抑制活性的综合评估

《Food Bioscience》：Comprehensive Evaluation of Phenolic Content, Antioxidant Potential, and Enzyme Inhibitory Activities of Origanum acutidens (Hand.-Mazz.) Ietsw. Extracts Obtained via Pressurized Hot Liquid Extraction

　　

ABSTRACT
尖叶牛至 (Origanum acutidens (Hand.-Mazz.) Ietsw.) 是一种土耳其特有的药用植物，因其高多酚含量和传统用途而备受关注。本研究评估了加压热液萃取条件对提取率、酚类成分、抗氧化特性及胆碱酯酶抑制活性的影响。提取实验使用水、甲醇和乙醇在 50、100 和 150 °C 下进行。在 150 °C 下通过亚临界水萃取获得了最高的提取率 (49.5%)。在 150 °C 下获得的乙醇提取物表现出最高的总多酚含量，并在 ABTS+、CUPRAC 和 FRAP 测定中显示出最强的活性。相比之下，在 150 °C 下获得的甲醇提取物中观察到最高的总黄酮含量，而在 50 °C 下获得的甲醇提取物中检测到最强的 DPPH 自由基清除活性。此外，在 100 °C 下获得的甲醇提取物显示出最强的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性，其次是乙醇。UHPLC-HESI-Orbitrap?-HRMS2 分析鉴定了 25 种酚类化合物，并揭示在 150 °C 加压热水萃取中迷迭香酸含量增加了约 50 倍。总体而言，研究结果表明加压热液萃取是一种有效的提取方法，可增强从尖叶牛至中回收生物活性化合物。

Introduction
药用芳香 (Medi-Aro) 植物含有丰富的芳香和治疗性代谢物，几个世纪以来被广泛用作各个工业领域的来源 (Yadav & Agarwala, 2011; Goti & Dasgupta, 2023; Nurzyńska-Wierdak & Walasek-Janusz, 2025)。Medi-Aro 植物是食品、化妆品和药理产品的宝贵资源，在自然条件下或受控条件下种植 (Nurzyńska-Wierdak & Walasek-Janusz, 2025)。唇形科包括用于食品和药品的地中海植物物种，如牛至属 (Origanum)、百里香属 (Thymus)、细茎牛至属 (Satureja)、冬青牛至属 (Tymbra) 和香牛至属 (Coridothymus) 等属。牛至植物因其刺激、健胃、祛痰、发汗、催经和消毒特性而长期用于医学 (Kaya & Y?ld?r?m, 2024)。

在唇形科家族中，还包含尖叶牛至 (Origanum acutidens (Hand.-Mazz.) Ietsw.) 等特有物种，有许多在医学、化妆品和食品行业有潜在应用的宝贵植物 (?oban et al., 2024)。O. acutidens 生长在湿度低、阳光充足的石灰岩坡上，开粉白色花 (Karag?z & Karag?z, 2019)。除用于景观实践外，O. acutidens 还用于医学和食品行业 (?oban et al., 2024)。迷迭香酸、百里香酚和香芹酚是该物种中发现的几种主要具有强效抗菌特性的酚类化学物质 (Burt, 2004; Kernou et al., 2023; ?oban et al., 2024)。

植物来源的植物化学物质以其治疗特性而闻名，被认为是天然药物的“活性物质”或“活性成分” (Zhang et al., 2018; Goti & Dasgupta, 2023)。此外，它们通过表现出抗炎和抗增殖效应，为人类提供重要的健康益处 (Süzerer et al., 2024; K?l?? et al., 2025)。次生代谢产物 (SMs) 是植物细胞代谢产生的具有药理和毒理学效应的生物活性物质 (A??kba?, 2023; Süzerer et al., 2024)。植物中的 SMs 是帮助它们适应生物和非生物刺激 的物质 (Shiade et. al., 2024)。这些代谢物作为天然抗氧化剂发挥重要作用，并在抵御氧化应激的防御机制中发挥关键功能。它们通过中和生物和非生物胁迫条件下产生并可能损害细胞成分的活性氧 (ROS) 来保护植物。

酚类化合物的抗氧化能力通常使用各种分光光度法测定。常用方法包括 2,2-二苯基 -1-苦基肼 (DPPH)、2,2-联氮 - 双 -(3-乙基 - 苯并噻唑 -6-磺酸 (ABTS+)、铁还原抗氧化能力 (FRAP) 和铜离子还原抗氧化能力 (CUPRAC) 测定 (Chaves et al., 2020; Süzerer et al., 2024; K?l?? et al., 2025)。UHPLC-HESI-Orbitrap?-HRMS2 方法通过在 MS2 模式下提供高质量分辨率和准确的质量测定，提供了卓越的结构确认，使其成为文献中广泛用于酚类化合物定量分析的优选技术 (Dursun et al., 2025; Gelen et al., 2025; K?l?? et al., 2025)。

所使用的提取技术、溶剂和温度对从植物中提取生物活性化学物质的成功与否在定性和定量上都有重大影响 (Bitwell et al., 2023; Süzerer et al., 2024)。用于获得植物来源生物活性化合物的提取方法通常分为两大类：常规技术和现代技术。与传统方法不同，现代提取技术具有多个优势，包括处理时间短、溶剂消耗减少、高温和高压应用提高产量、适合自动化以及同时使用多种溶剂的可能性 (Süzerer et al., 2024; Mungwari et al, 2025)。

在本研究中，采用了一种现代提取技术 - 加压热液萃取 (PHLE)。与许多常规和现代方法相比，PHLE 更快、更高效、可重复、更环保、更用户友好且更节能 (Jentzer et al., 2015; Klongdee and Klinkesorn, 2022)。该方法能够在高温高压下使用，促进了溶剂和植物基质之间的更好相互作用。该方法可以大大增加水在高压和高温下的溶剂容量。随着提取温度的升高，传质、解吸动力学和溶解度都会提高。温度的影响通常与极性变化和氢键减弱有关 (Nile et al., 2019)。使用介于水的环境沸点 100 °C (373 K, 0.1 MPa) 和其临界点 374 °C (647 K, 22.1 MPa) 之间的温度和压力值，以在压力下保持水处于液相。在这些条件下，水的极性降低，从而增加了其溶解非极性植物化学物质的能力。因此，对于某些化合物，水可以达到与有机溶剂相当 的提取性能。因此，在加压热水萃取 (PHWE) 中，水可以作为提取广泛极性和相对非极性植物化学物质的有效溶剂 (Kova?evi? et al., 2018; Süzerer et al., 2024)。

然而，在使用 PHWE 提取植物化学物质时，确定目标化合物的最佳温度至关重要。文献中有关于使用加压热水的研究；酚类化合物已成功从酒葡萄的加压酸性热水提取物 (Ju & Howard, 2003) 和辣木的加压热水提取物 (Matshediso et al., 2015; Nuapia et al., 2020) 中提取。关于从甜叶菊叶片中回收糖苷，发现在 160 °C 下提取比 100 °C 更成功 (Kova?evi? et al., 2018)。在卡努卡 (Kunzea ericoides) 植物样本中，在 60 °C 和 220 °C 之间进行的 PHWE 期间，挥发性有机化合物的最高回收率是在 120 °C 提取条件下获得的 (Devadass et al., 2025)。在升高的温度和压力下，水的介电常数和极性降低，增强了其溶解较少极性植物化学物质 的能力，除了极性化合物。由于这种特性，与 100°C 相比，在 160°C 下以更有效的产量获得了极性和非极性抗氧化剂以及甜菊糖苷 (Kova?evi? et al., 2018)。另一方面，提取效率有时可能在高温下降低；例如，在从普通百里香中提取百里醌时，110 °C 比 200 °C 更有效 (Shin & Ko, 2025)。已确定高温导致植物化学物质的降解 (Vergara-Salinas et al., 2012)。在从开心果壳中提取没食子鞣质和黄酮醇时，发现水比甲醇 - 水提取更有效，与其他溶剂相比，PHWE 中的水表明在回收植物化学物质方面更优越 (Er?an et al., 2018)。

由于预期寿命的增加，被诊断为阿尔茨海默病 (AD) 的个人发病率一直在上升，AD 被认为是全球痴呆症的最主要原因之一。AD 占痴呆症病例的相当大比例，主要影响老年人群。在 85 岁以上人群中，患病率高达 30% (Mendez, 2019; Venkatraghavan et al., 2019)。虽然 AD 的致病机制尚未完全了解，但公认该疾病是由众多因素复杂相互作用导致的慢性、进行性神经退行性障碍。最近提出了几种假设来阐明该疾病潜在的病理生理过程。其中值得注意的是胆碱能假说、tau 蛋白过度磷酸化假说、β-淀粉样蛋白 (Aβ) 肽理论以及基于氧化应激综合研究的提议 (Jalili-Baleh et al., 2018)。

胆碱能神经元退行性变以及由此导致的乙酰胆碱 (ACh) 介导的神经传递减少，极大地导致了 AD 中的认知能力下降。乙酰胆碱酯酶 (AChE) 和丁酰胆碱酯酶 (BChE) 通过水解 ACh 来调节胆碱能传递。因此，抑制这些酶会增加突触 ACh 可用性，代表了缓解 AD 症状的既定策略 (Sharma, 2019; Behl et al., 2023)。尽管在正常情况下 AChE 主要负责 ACh 水解，但在疾病进展过程中 BChE 的相对贡献可能会增加。BChE 也有助于脂质代谢和异源生物解毒 (Habieb et al., 2021; Petrovi? et al., 2017)。因此，这两种酶都被认为是 AD 管理中的相关治疗靶点 (Kappenberg et al., 2022)。由于目前没有 AD 的根治方法，植物来源的化合物正越来越多地被研究作为胆碱酯酶抑制剂和神经保护剂的潜在来源 (?omakl? et al., 2023; Jaipea et al., 2023)。

阿尔茨海默病 (AD) 是一种进行性神经退行性障碍，其患病率随年龄增长而增加，在 85 岁以上人群中达到约 30% (Mendez, 2019; Venkatraghavan et al., 2019)。其发病机制涉及胆碱能功能障碍、β-淀粉样蛋白积累、tau 蛋白过度磷酸化和氧化应激 (Jalili-Baleh et al., 2018)。胆碱能神经元退行性变导致乙酰胆碱 (ACh) 水平降低并导致认知能力下降。因此，抑制水解 ACh 的乙酰胆碱酯酶 (AChE) 和丁酰胆碱酯酶 (BChE) 可以增强胆碱能传递并缓解 AD 症状 (Sharma, 2019; Kappenberg et al., 2022)。由于目前尚无根治方法，植物来源的化合物正越来越多地被研究作为胆碱酯酶抑制剂的潜在来源 (?omakl? et al., 2023; Jaipea et al., 2023)。

本研究是第一份综合报告，通过分析尖叶牛至乙醇、甲醇和水提取物，利用 UHPLC-HESI-Orbitrap?-HRMS2 评估其抗氧化 (DPPH, ABTS, CUPRAC 和 FRAP)、总多酚含量 (TPC)、总黄酮含量 (TFC) 和神经保护酶抑制能力，以服务于制药和功能性食品行业。虽然提供了关于溶剂类型和温度的关键数据，但研究侧重于对选定 PHLE 条件的比较评估，而不是全面的过程优化。因此，未来的研究应使用多变量实验设计调查剩余不变变量，如提取时间、压力和静态周期，以确定最有效的提取条件。

Section snippets
试剂
以下试剂购自 Sigma–Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)：过硫酸钾 (K2S2O8)、6-羟基 -2,5,7,8-四甲基 -2-羧基色满酸 (Trolox)、没食子酸 (GA)、槲皮素 (QE)、氢氧化钠 (NaOH)、氯化钠、盐酸 (37%)、硝酸、TPTZ (2,4,6-三 [2-吡啶基]-s-三嗪)、来自电鳗的乙酰胆碱酯酶、来自马血清的丁酰胆碱酯酶、乙酰硫代胆碱碘化物、丁酰硫代胆碱碘化物、5,5′-二硫代双

Results and discussion
本研究旨在调查在 50 °C、100 °C 和 150 °C 下使用乙醇、甲醇和水等不同溶剂进行的 PHLE 应用对尖叶牛至提取物的生物活性和酚类化合物谱的影响。提取物的 TPC、TFC 和抗氧化活性 (DPPH, ABTS, CUPRAC 和 FRAP) 结果，以及从校准曲线获得的相关系数 (R2)，列于表 2 中，而部分...

Conclusion
本研究首次对土耳其特有种尖叶牛至进行了全面评估，使用乙醇、甲醇和水在 50、100 和 150 °C 下进行 PHLE。尽管水提取物在较低温度下多酚含量和生物活性较低，但在 150 °C 下显示出最大的产量改善，所有溶剂在较高温度下均持续提高了提取率。迷迭香酸浓度显示出显著的溶剂依赖性波动，并且 25

Declaration of generative AI and AI-assisted technologies in the manuscript preparation process
在稿件准备过程中关于生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明
在准备本工作过程中，作者部分使用了 ChatGPT (OpenAI, GPT-5.5) 和 Grammarly 来协助学术英语翻译、语言编辑和语法优化。在使用该工具后，作者仔细审查和修订了内容，如有必要，并对已发表文章的内容承担全部责任。

CRediT authorship contribution statement
CRediT 作者贡献声明
Abdurrahman ??M?EK: 写作 - 审阅与编辑，调查。Ali S?NAN: 写作 - 审阅与编辑，资源，调查，数据整理。Rüya SA?LAMTA?: 写作 - 审阅与编辑，资源，调查，数据整理。

Piroz DüZDABAN：写作 – 审查与编辑，可视化，调查，数据整理。
?nan DURSUN：写作 – 审查与编辑，写作 – 原创草稿，验证，资源，方法论，调查，形式分析，数据整理。
Veysel SüZERER：写作 – 未引用参考文献 Akdeniz 等人，2021；Arserim-U?ar 等人，2020；de OX Machado 等人，2024；Gil-Ramirez 等人，2018；S?kmen 等人，2004；Süzerer，2026。
利益冲突声明
作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。
数据可用性
支持本研究结果的部分数据包含在补充材料中。合理请求下，可向通讯作者获取额外数据。
利益冲突声明
? 作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些可能被认为会影响本文报告的工作。
致谢
作者想向 Ahmet Onay 博士表示感激，感谢他帮助进行文章的语言评估，并就如何解释研究结果提供指导。Bing?l 大学科学研究项目协调单位 (BüBAP) 根据项目编号 P?KOM-Ar?.2019.010 为本研究提供了部分资金 [伞形项目是以区域发展为导向的使命差异化和专业化计划（项目编号 2017K214000），由总统府资助]
Veysel SüZERER|?nan DURSUN|Piroz DüZDABAN|Rüya SA?LAMTA?|Ali S?NAN|Abdurrahman ??M?EK
土耳其 Bing?l 省 Bing?l 大学健康服务职业学院药学服务系